Publicação: Análise do potencial dos ácidos graxos derivados da geleia real como inibidores de desacetilases de histonas: perspectivas para a descoberta de novas epidrugs com efeitos antitumorais
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Autores
Orientador
Rainho, Cláudia Aparecida 
Coorientador
Pós-graduação
Curso de graduação
Botucatu - IBB - Ciências Biomédicas
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Editor
Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Tipo
Trabalho de conclusão de curso
Direito de acesso
Acesso restrito
Resumo
Resumo (português)
O câncer é um conjunto complexo e heterogêneo de doenças decorrente do acúmulo de alterações genéticas e epigenéticas. Globalmente, foram diagnosticados 19,3 milhões de novos casos de câncer em 2020, segundo dados do Observatório Global de Câncer (GLOBOCAN), sendo o câncer de mama o tipo de maior incidência, seguido pelos cânceres de pulmão e colorretal. A desregulação epigenética é fundamental no processo de carcinogênese, desde o desenvolvimento e progressão tumoral, até a aquisição de resistência à quimioterapia. Dentre os alvos potenciais no desenvolvimento de novas terapias no tratamento do câncer, as desacetilases de histonas (HDACs), principalmente as de classe I, são uma das famílias mais estudadas em ensaios clínicos para a elaboração de estratégias de terapia epigenética. As HDACs atuam na modulação dos estados de cromatina, sendo associadas ao silenciamento de genes relacionados ao câncer. À vista disso, os inibidores de desacetilases de histonas (HDACi) têm ganhado destaque como terapia epigenética promissora para tratamentos oncológicos, principalmente em combinação com outras abordagens terapêuticas. Na literatura, estudos apontam o 10-hidroxi-2-decenóico (10-HDA), componente exclusivo da geleia real, como um potencial novo HDACi. Estruturalmente, o 10-HDA e o 10-HDAA (ácido 10-hidroxidecanóico) são semelhantes e representam os ácidos graxos predominantes na geleia real. Nesse sentido, o presente estudo visa avaliar os efeitos do tratamento in vitro dos ácidos graxos derivados da geleia real nos níveis de expressão das HDACs de classe I, bem como na atividade bioquímica dessas enzimas, na linhagem MDA-MB-231 e HCT116, derivadas de carcinomas mamário e de cólon humano, respectivamente. Para o ensaio de atividade enzimática, a linhagem MDA-MB-231 foi exposta a tratamentos com 10-HDA, 10-HDAA e a combinação 10-HDA e 10-HDAA, na concentração de 100 μM, além dos controles negativo, contendo o diluente DMSO (dimetilsulfóxido), e positivo, contendo um HDACi conhecido (TSA – Tricostatina A), por um período de tratamento de 12 ou 24 horas. Os extratos nucleares foram obtidos com o CelLytic™ NuCLEAR™ Extraction Kit (SIGMA) e a atividade enzimática relativa das HDACs de classe I foi determinada com o uso do Histone Deacetylase 3 (HDAC3) Activity Assay Kit (SIGMA). Experimentos de RT-qPCR foram delineados para a investigação dos níveis de expressão destes genes nas linhagens MDA-MB-231 e HCT116 expostas às mesmas condições. Os experimentos foram realizados em triplicatas técnicas e os tratamentos tiveram duração de 72 horas. A extração do RNA total foi realizada a partir do AllPrep DNA/RNA/miRNA Universal kit (QIAGEN). O RNA foi purificado com DNase I Amplification Grade (Invitrogen) e, tendo como molde o RNA total, o cDNA foi obtido com SuperScript II Reverse Transcriptase (Invitrogen). A análise da expressão gênica das HDACs de classe I foi determinada por RT-qPCR (Reverse Transcriptase – quantitative Polymarase Chain Reaction). A expressão relativa foi calculada pelo método Ct comparativo, sendo utilizado o controle endógeno GAPDH para a normalização. As análises estatísticas foram realizadas no software GraphPad Prism versão 10, sendo realizado o teste ANOVA, seguido pelo teste de Dunnett para comparações múltiplas, considerando significativo valores de p<0,05. Nas condições testadas, foram verificadas diferenças significativas entre os tratamentos nos níveis de expressão do gene codificador da HDAC8 expostos ao 10-HDA e 10-HDAA isolados, na linhagem HCT116, enquanto na linhagem MDA-MB-231 não foram observadas diferenças significativas entre os tratamentos nos níveis de expressão dos genes das HDACs de classe I. Contudo, a exposição in vitro ao 10-HDA e 10-HDAA isolados, na linhagem MDA-MB-231, resultou em uma diminuição significativa da atividade enzimática após 12 horas (p<0,05); porém, após 24 horas de exposição, verificou-se um aumento significativo da atividade da HDAC3 nas células tratadas com 10-HDA e 10-HDAA em associação (p<0,001). Nossos resultados indicam que a geleia real é uma fonte de compostos químicos para a descoberta de novas epidrugs, assim como reforçam achados prévios acerca do potencial dos ácidos graxos como inibidores de desacetilases de histonas.
Resumo (inglês)
Cancer is a complex and heterogeneous group of diseases resulting from the accumulation of genetic and epigenetic alterations. Globally, 19.3 million new cancer cases were diagnosed in 2020, according to data from the Global Cancer Observatory (GLOBOCAN), with breast cancer being the most prevalent type, followed by lung and colorectal cancers. Epigenetic dysregulation plays a crucial role in carcinogenesis, from tumor development and progression to the acquisition of chemotherapy resistance. Among the potential targets for developing new cancer therapies, histone deacetylases (HDACs), especially class I HDACs, are one of the most studied families in clinical trials for designing epigenetic therapy strategies. HDACs modulate chromatin states, being associated with the silencing of cancer-related genes. Histone deacetylase inhibitors (HDACi) have emerged as a promising epigenetic therapy for cancer treatment, particularly in combination with other therapeutic approaches. In the literature, studies point to 10-hydroxy-2-decenoic acid (10-HDA), an exclusive component of royal jelly, as a potential new HDACi. Structurally, 10-HDA and 10-HDAA (10-hydroxydecanoic acid) are similar and represent the predominant fatty acids in royal jelly. This study aims to evaluate the effects of in vitro treatment with fatty acids derived from royal jelly on the expression levels of class I HDACs and the biochemical activity of these enzymes in MDA-MB-231 and HCT116 cell lines derived from human breast and colon carcinomas, respectively. For the enzymatic activity assay, MDA-MB-231 cells were exposed to treatments with 10-HDA, 10-HDAA, and the combination of 10-HDA and 10-HDAA at a concentration of 100 μM, along with negative control containing the diluent DMSO (dimethyl sulfoxide) and positive control containing a known HDACi (Trichostatin A - TSA), for a treatment period of 12 or 24 hours. Nuclear extracts were obtained using the CelLytic™ NuCLEAR™ Extraction Kit (SIGMA), and the relative enzymatic activity of class I HDACs was determined using the Histone Deacetylase 3 (HDAC3) Activity Assay Kit (SIGMA). RT-qPCR experiments were designed to investigate the expression levels of these genes in MDA-MB-231 and HCT116 cell lines exposed to the same conditions. The experiments were conducted in technical triplicates, and the treatments lasted for 72 hours. Total RNA extraction was performed using the AllPrep DNA/RNA/miRNA Universal kit (QIAGEN). RNA was purified with DNase I Amplification Grade (Invitrogen), and using total RNA as a template, cDNA was obtained with SuperScript II Reverse Transcriptase (Invitrogen). The gene expression analysis of class I HDACs was determined by RT-qPCR (Reverse Transcriptase – quantitative Polymerase Chain Reaction). Relative expression was calculated using the comparative Ct method, with the endogenous control GAPDH for normalization. Statistical analyses were performed using GraphPad Prism version 10, employing ANOVA followed by Dunnett's test for multiple comparisons, considering p<0.05 as significant. Under the tested conditions, significant differences were observed between treatments in the expression levels of the gene encoding HDAC8 exposed to 10-HDA and 10-HDAA alone in the HCT116 cell line, while in the MDA-MB-231 cell line, no significant differences were observed in the expression levels of class I HDAC genes. However, in vitro exposure to 10-HDA and 10-HDAA alone in the MDA-MB-231 cell line resulted in a significant decrease in enzymatic activity after 12 hours (p<0.05). Still, after 24 hours of exposure, a significant increase in HDAC3 activity was observed in cells treated with the combination of 10-HDA and 10-HDAA (p<0.001). Our results indicate that royal jelly is a source of chemical compounds for the discovery of new epidrugs, supporting previous findings regarding the potential of fatty acids as histone deacetylase inhibitors.
Descrição
Palavras-chave
10-HDA, 10-HDAA, Câncer, Desacetilases de histonas, Geleia real, Ácidos graxos
Idioma
Português
