Modificações estratégicas em peptídeos derivados da Histatina 5 para potencializar sua ação antifúngica contra Candida albicans
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Data
Autores
Orientador
Garrido, Saulo Santesso 
Coorientador
Trovatti, Eliane
Pós-graduação
Biotecnologia - IQAR
Curso de graduação
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Editor
Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Tipo
Tese de doutorado
Direito de acesso
Acesso restrito
Resumo
Resumo (português)
As infecções causadas pelo fungo da espécie Candida albicans são responsáveis pela maior parte das infecções fúngicas no mundo, causando alta incidência de morte. Candida albicans pode infectar diversos tecidos e órgãos, por exemplo, mucosa oral, pele, trato respiratório superior, intestinos, vagina, trato urinário, dentre outros. Devido ao surgimento de uma elevada resistência contra os antifúngicos existentes no mercado, novas alternativas devem ser estudadas para melhorar o tratamento de infecções fúngicas provocadas por esta espécie. Os peptídeos antimicrobianos podem ser uma alternativa promissora para esta finalidade, principalmente por apresentarem alta seletividade e baixa citotoxicidade. Um exemplo destes peptídeos é a Histatina 5, um peptídeo natural encontrado na saliva humana. Visando o aumento do potencial antifúngico do peptídeo Histatina 5, foram propostos neste trabalho a síntese de fragmentos peptídicos (10AH5, 11AH5, 10WH5, 11WH5, Ac10WH5NH2, Ac11WH5NH2, 10WH5K1,7D, 11WH5K1,7D, Ac10WH5K1,7DNH2 e Ac11WH5K1,7DNH2) derivados da sequência de aminoácidos da Histatina 5, porém com modificações pontuais, com o objetivo de investigar seus potenciais antifúngicos individualmente e na forma combinada, bem como buscar o entendimento de seus mecanismos de ação. Os peptídeos foram sintetizados quimicamente utilizando o método de síntese em fase sólida. Em seguida foram purificados por cromatografia líquida de alta eficiência e caracterizados por espectrometria de massas. As investigações da citotoxicidade e do potencial antifúngico foram realizadas através dos testes de MTT, concentração inibitória mínima (CIM), inibição e prevenção de biofilme, ensaio de checkerboard e índice da concentração inibitória fracionada (ICIF). Os peptídeos apresentaram alta pureza (≥95%) e baixa citotoxicidade em células de fibroblasto (L929). Para avaliação antifúngica foi utilizado a cepa de Candida albicans ATCC 90028 e foi observado que os peptídeos 11AH5, 11WH5 e 10WH5K1,7D possuem atividade antifúngica na concentração mínima de 160 µmol L-1. Os peptídeos Ac10WH5NH2, Ac11WH5NH2, 11WH5K1,7D, Ac10WH5K1,7DNH2 e Ac11WH5K1,7DNH2 apresentaram atividade antifúngica na concentração mínima de 80 µmol L-1. Os peptídeos 10AH5 e 10WH5 necessitam de uma concentração maior que 160 µmol L-1 para ter ação antifúngica. Estes mesmos resultados foram observados nos testes de time-kill em 48 horas de tratamento. Na concentração de 160 µmol L-1 os peptídeos 11AH5, 11WH5, Ac10WH5NH2, Ac11WH5NH2, 10WH5K1,7D, 11WH5K1,7D, Ac10WH5K1,7DNH2 e Ac11WH5K1,7DNH2 preveniram a formação de biofilme em mais de 85%, resultados semelhantes a atividade do peptídeo natural (Histatina 5). Em concentrações menores foi observado que os peptídeos diminuíram seu potencial anti-biofilme. Na inibição de biofilme pré formado os peptídeos têm a necessidade de maior concentração para alcançar efeitos antifúngicos desejados. Na concentração de 320 µmol L-1, os peptídeos 10WH5, 11WH5, 10WH5K1,7D, 11WH5K1,7D, Ac10WH5K1,7DNH2 e Ac11WH5K1,7DNH2 foram capazes de inibirem em 46,9%, 46%, 50,5%, 55,7%, 57,2% e 49% respectivamente, os biofilmes pré-formados. Quando combinados os peptídeos possuem potencial antifúngico nas concentrações fracionadas mínimas menor que a concentração inibitória mínima de forma isolada. Os ICIF das combinações dos peptídeos foram determinados como sinérgico, uma vez que as combinações dos peptídeos obtiveram a ICIF igual ou inferior a 0,5. O principal mecanismo de ação fungicida dos peptídeos é a apoptose. Dessa forma podemos dizer que os peptídeos de forma individual e, principalmente combinados, possuem atividades antifúngicas, podendo ser uma alternativa promissora no tratamento de infecções causadas por Candida albicans.
Resumo (inglês)
Infections caused by the fungus Candida albicans are responsible for most fungal infections worldwide, causing a high incidence of death. Candida albicans can infect various tissues and organs, such as the oral mucosa, skin, upper respiratory tract, intestines, vagina, urinary tract, among others. Due to the emergence of high resistance to existing antifungal drugs on the market, new alternatives must be studied to improve the treatment of fungal infections caused by this species. Antimicrobial peptides may be a promising alternative for this purpose, mainly because they have high selectivity and low cytotoxicity. An example of these peptides is Histatin 5, a natural peptide found in human saliva. Aiming to increase the antifungal potential of the Histatin 5 peptide, this study proposed the synthesis of peptide fragments (10AH5, 11AH5, 10WH5, 11WH5, Ac10WH5NH2, Ac11WH5NH2, 10WH5K1,7D, 11WH5K1,7D, Ac10WH5K1,7DNH2, and Ac11WH5K1,7DNH2) with specific modifications derived from the amino acid sequence of Histatin 5 was proposed in this study to investigate their antifungal potential individually and in combination and their mechanism of action. The peptides were chemically synthesized using the solid-phase synthesis method. They were then purified by high-performance liquid chromatography and characterized by mass spectrometry. Investigations of cytotoxicity and antifungal potential were performed using MTT assays, minimum inhibitory concentration (MIC), biofilm inhibition and prevention, checkerboard assay, and fractional inhibitory concentration index (ICIF). The peptides showed high purity (≥95%) and low cytotoxicity in fibroblast cells (L929). For the antifungal evaluation, the Candida albicans ATCC 90028 strain was used, and it was observed that peptides 11AH5, L-1, the 11WH5, and 10WH5K1,7D have antifungal activity at a minimum concentration of 160 µmol peptides Ac10WH5NH2, Ac11WH5NH2, 11WH5K1,7D, Ac10WH5K1,7DNH2, and Ac11WH5K1,7DNH2 have antifungal activity at a minimum concentration of 80 µmol L-1, and the peptides 10AH5 and 10WH5 require a concentration greater than 160 µmol L-1 to have antifungal action. After 48 hours of treatment, the same results were observed in the time-kill tests. At a concentration of 160 µmol L-1, peptides 11AH5, 11WH5, Ac10WH5NH2, Ac11WH5NH2, 10WH5K1,7D, 11WH5K1,7D, Ac10WH5K1,7DNH2, and Ac11WH5K1,7DNH2 prevented biofilm formation by more than 90%, results similar to the activity of the natural peptide (Histatin 5). At lower concentrations, it was observed that the peptides decreased their anti-biofilm potential. In the inhibition of preformed biofilm, the peptides require higher concentrations to achieve the desired antifungal effects. At a concentration of 320 µmol L-1, peptides 10WH5, 11WH5, 10WH5K1,7D, 11WH5K1,7D, Ac10WH5K1,7DNH2, and Ac11WH5K1,7DNH2 were able to inhibit preformed biofilms by 46.9%, 46%, 50.5%, 55.7%, 57.2%, and 49%, respectively. When combined, the peptides have antifungal potential at minimum fractional concentrations lower than the minimum inhibitory concentration in isolation. The ICIF of the peptide combinations was determined to be synergistic, since the peptide combinations obtained an ICIF equal to or less than 0.5. The main fungicidal mechanism of action of peptides is apoptosis. Thus, we can say that peptides individually and, especially when combined, have antifungal activities and may be a promising alternative in the treatment of infections caused by Candida albicans.
Descrição
Palavras-chave
Antibióticos peptídicos, Saliva, Candida albicans, Biofilmes, Apoptose
Idioma
Português
Citação
TORRES, André Henrique Furtado. Modificações estratégicas em peptídeos derivados da Histatina 5 para potencializar sua ação antifúngica contra Candida albicans. 2025. 136 f. Tese (Doutorado em Biotecnologia) - Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, Araraquara, 2025.
