Potencial de transdiferenciação in vitro de células tronco mesenquimais equinas em células schwann-like

Abstract

As lesões do sistema nervo periférico (SNP) são condições clínicas comuns que podem desencadear déficits funcionais, afetando a qualidade de vida de humanos e equinos. As lesões do nervo facial são comumente observadas nestas espécies. Para o processo de regeneração, as células de Schwann (CS) são fundamentais, pois proliferam e produzem fatores neurotróficos. Contudo, a sua utilização como terapia celular é limitada devido à disponibilidade destas células e do tempo de cultivo. Neste contexto, busca-se desenvolver tecnologias ou métodos alternativos para a geração de CS. Diversos estudos demonstram a capacidade das células tronco mesenquimais (CTM) se transdiferenciarem em células de Schwann-like (CSL) utilizando a co-cultura com CS ou protocolos químicos. Entretanto, são métodos de difícil execução e com custos elevados. Uma abordagem mais prática para induzir a transdiferenciação in vitro das CTM foi descrita com sucesso utilizando meio de cultura condicionado com fatores neurotróficos secretados do nervo isquiático de ratos. O objetivo deste estudo foi avaliar o potencial de transdiferenciação in vitro de CTM equinas derivadas do tecido adiposo (TA), medula óssea (MO) e cordão umbilical (CU) em CSL. Neste estudo, o nervo facial de um equino adulto foi coletado após o procedimento de eutanásia. O nervo foi seccionado em fragmentos e incubado em meio de cultura completo por 48 horas. Este meio foi filtrado e utilizado como meio de indução para transdiferenciação das CTM em CSL. As CTM foram previamente caracterizadas imunofenotípicamente pela expressão dos marcadores CD44, CD90, CD105 e ausência da expressão dos marcadores CD34 e MHC-II; e pela capacidade de diferenciação em linhagem mesenquimal osteogênica, condrogênica e adipogênica. As CTM-TA, CTM-MO, CTM-CU equinas foram incubadas com o meio de indução por cinco dias. Após este período foi avaliado a morfologia, a expressão gênica dos marcadores glias S100β e GFAP (proteína ácida fibrilar da glia), do fator de crescimento do nervo (NGF), fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), fator neurotrófico derivado da glia (GDNF) e realizado a imunofluorescência de S100 e GFAP. As CTM-TA e CTM-MO incubadas com o meio de indução exibiram morfologia bipolar e/ou tripolar com grandes núcleos, processos citoplasmáticos alongados, semelhantes à morfologia SC. Já nas CTM-CU não foram observadas alterações morfológicas. Houve aumento significativo na expressão gênica de BDNF, GDNF, GFAP e S100β nas CTM-TA, de GDNF, GFAP e S100β nas CTM-MO e de GDNF nas CTM-CU pós-diferenciação. Não verificamos a expressão gênica de GFAP em nenhuma das amostras, mas a expressão de S100β foi observada em todas as amostras após o processo de transdiferenciação das CTM-CU. A imunofluorescência revelou a expressão proteica de GFAP nas CTM-TA, CTM-MO e CTM-CU equinas indiferenciadas e diferenciadas. Entretanto, S100 foi expresso apenas em CTM-TA e CTM-MO equinas diferenciadas. Nossos resultados indicam a transdiferenciação das CTM-TA e CTM-MO equinas em CSL. Portanto, o protocolo de transdiferenciação de CTM-TA e CTM-MO equinas proposto neste estudo mostrou-se eficiente. Contudo, nossos dados não foram consistentes em relação as CTM-CU equinas e não verificamos a capacidade de transdiferenciação dessas células em CSL.

Peripheral nerve system (PNS) injuries are common clinical conditions that can trigger functional deficits, affecting the quality of life of humans and horses. Facial nerve injuries are commonly seen in these species. For the regeneration process, Schwann cells (SCs) are essential, as they proliferate and produce neurotrophic factors. However, its use as cell therapy is limited due to the availability of these cells and the time of cultivation. In this context, we seek to develop alternative technologies or methods for the generation of SCs. Several studies demonstrate the ability of mesenchymal stem cells (MSCs) to transdifferentiate into Schwann-like cells (SLCs) using co-culture with SCs or chemical protocols. However, these are complicated and expensive methods. A more practical approach to induce MSCs transdifferentiation in vitro was successfully described using culture medium conditioned with neurotrophic factors secreted from the sciatic nerve of rats. The aim of this study was to evaluate the in vitro transdifferentiation potential of equine MSCs derived from adipose tissue (AT), bone marrow (BM) and umbilical cord (UC) into SLCs. In this study, the facial nerve of an adult horse was collected after the euthanasia procedure. The nerve was cut into fragments and incubated in complete culture medium for 48 hours. This medium was filtered and used as an induction medium to transdifferentiate MSCs into SLCs. MSCs were previously immunophenotypically characterized by the expression of markers CD44, CD90, CD105 and absence of expression of markers CD34 and MHC-II; and by the ability to differentiate into osteogenic, chondrogenic and adipogenic mesenchymal lineages. The equine AT-MSCs, BM-MSCs, UC-MSCs were incubated with the induction medium for five days. After this period, the morphology, gene expression of glial markers S100β and GFAP (glial fibrillary acidic protein), and nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), glial-derived neurotrophic fator (GDNF) and immunofluorescence of S100 and GFAP was performed. AT-MSCs and BM-MSCs incubated with the induction medium exhibited bipolar and/or tripolar morphology with large nuclei, elongated cytoplasmic processes, similar to SCs morphology. In the UC-MSCs, no morphological changes were observed. There was a significant increase in the gene expression of BDNF, GDNF, GFAP and S100β in AT-MSCs, of GDNF, GFAP and S100 in BM-MSCs and of GDNF in UC-MSCs post-differentiation. We did not verify the gene expression in any of the GFAP samples, but the expression of S100β was observed in all samples after the UC-MSCs transdifferentiation process. Immunofluorescence revealed GFAP protein expression in undifferentiated and differentiated equine AT-MSCs, BM-MSCs and UC-MSCs. However, S100 was expressed only in differentiated equine AT-MSCs and BM-MSCs. Our results indicate the transdifferentiation of equine AT-MSCs and BM-MSCs into SLCs. Therefore, the equine TA-MSCs and BM-MSCs transdifferentiation protocol proposed in this study proved to be efficient. However, our data were not consistent in relation to equine UC-MSCs and we did not verify the ability of these cells to transdifferentiate into SLCs.