Publicação: Avaliação molecular de MICA e MICB em indivíduos saudáveis: quantificação de RNA e moléculas de membrana
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Data
Autores
Orientador
Castro, Camila Ferreira Bannwart 
Coorientador
Castelli, Erick da Cruz
Pós-graduação
Biologia Geral e Aplicada - IBB
Curso de graduação
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Editor
Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Tipo
Dissertação de mestrado
Direito de acesso
Acesso restrito
Resumo
Resumo (português)
Os genes MICA e MICB pertencem ao complexo principal de histocompatibilidade (MHC), considerada a região mais polimórfica do genoma humano. Esses genes codificam proteínas glicosiladas ancoradas à membrana, semelhantes às moléculas de MHC-I, mas que não se ligam à β2-microglobulina nem apresentam antígenos. MICA/B atuam como ligantes para o receptor ativador NKG2D, encontrado em células natural killer (NK) e linfócitos TCD8+. A interação de MICA/B e NKG2D desencadeia uma resposta citotóxica, com liberação de perforinas e granzimas nas células-alvo transformadas ou infectadas. No entanto, MICA/B possui a isoforma solúvel (sMICA/B) originada por clivagem proteica ou polimorfismo, o que impede a citotoxicidade celular de NK e TCD8+. Sendo assim, pelo fato dessas proteínas desempenham papeis importantes em várias condições clínicas como disfunções gestacionais, doenças autoimunes, rejeição de transplantes, neoplasias malignas e infecções intracelulares, o objetivo do presente trabalho foi correlacionar os alelos de MICA e MICB de indivíduos saudáveis com o perfil de expressão de mRNA e proteína na superfície de monócitos. Com base no sequenciamento de um projeto anterior, foram selecionados 20 indivíduos com genótipos de interesse (que codificam diferentes isoformas de MICA/B) para o cultivo de monócitos estimulados com lipopolissacarídeo de Escherichia coli (LPS). As células foram armazenadas com TRIzol para análise de expressão de RNA ou desacopladas com tripsina e marcadas com anticorpos anti-CD14, anti-MICA e anti-MICB para análise por citometria de fluxo. Foram determinados grupos de indivíduos com genótipos semelhantes para as análises. Genótipos semelhantes foram agrupados em indivíduos heterozigotos para o alelo MICA*008 (MICA*008 HET), indivíduos homozigotos para MICA*008 (MICA*008 HOM), cujos alelos codificam proteínas que podem permanecer retidas no citoplasma (MICA*010/017 RET) e aqueles que codificam a proteína completa (MICA*002 MEM). Para MICB, os grupos foram divididos em indivíduos com o alelo MICB*002 (MICB*002 RES), indivíduos portadores dos alelos MICB*004 (MICB*004 SUSC) e outros genótipos (MICB*005 UNK). Monócitos estimulados com LPS não aumentaram significativamente a expressão de mRNA de MICA e MICB, nem a expressão dessas moléculas na superfície celular em indivíduos saudáveis. Já quando comparamos os grupos, foi notável a alta porcentagem de positividade de monócitos para MICA no grupo MICA*008 HOM, o que pode ser explicado pela ancoragem da proteína truncada à membrana por meio do GPI. E uma baixa porcentagem de monócitos expressando MICA na superfície no grupo MICA*002 MEM, que pode ser explicada pela clivagem da molécula por metaloproteinases .E, por fim, um perfil de positividade de MICB na superfície dos monócitos foi compatível com a literatura, onde indivíduos que carregam o alelo MICB*004 (grupo MICB*004 SUSC) apresentou uma redução significativa da porcentagem de expressão na superfície celular. Uma vez que as moléculas de MICA e MICB são importantes mecanismos de ativação imune ou de escape em algumas doenças virais e cânceres, entender seu perfil molecular em pessoas saudáveis, especialmente em população miscigenada como a brasileira, poderá aprimorar diagnósticos e critérios de severidades de doenças, além de impulsionar avanços em imunoterapias futuras.
Resumo (inglês)
The MICA and MICB genes belong to the major histocompatibility complex (MHC), the most polymorphic region of the human genome. These genes encode glycosylated membrane-anchored proteins that resemble MHC-I molecules but do not bind to β2-microglobulin or present antigens. MICA/MICB function as ligands for the activating receptor NKG2D, which is expressed on natural killer (NK) cells and CD8+ T lymphocytes. The interaction between MICA/MICB and NKG2D triggers a cytotoxic response, leading to the release of perforins and granzymes against transformed or infected target cells. However, MICA/MICB also exist in a soluble isoform (sMICA/B), generated by proteolytic cleavage or polymorphism, which impairs NK and CD8+ T cell cytotoxicity. Given that these proteins play crucial roles in various clinical conditions, including gestational disorders, autoimmune diseases, transplant rejection, malignancies, and intracellular infections, the present study aimed to correlate MICA and MICB alleles in healthy individuals with mRNA expression profiles and protein surface expression on monocytes. Based on sequencing data from a previous project, 20 individuals with genotypes of interest (encoding different MICA/MICB isoforms) were selected for monocyte cultures stimulated with Escherichia coli lipopolysaccharide (LPS). The cells were either stored in TRIzol for RNA expression analysis or detached with trypsin and labeled with anti-CD14, anti-MICA, and anti-MICB antibodies for flow cytometry analysis. Individuals with similar genotypes were grouped for analysis. For MICA, groups included heterozygous carriers of the MICA*008 allele (MICA*008 HET), homozygous carriers of MICA*008 (MICA*008 HOM)—whose alleles encode proteins that may remain intracellularly retained (MICA*010/017 RET) and those encoding the full-length protein (MICA*002 MEM). For MICB, groups were categorized as carriers of the MICB*002 allele (MICB*002 RES), carriers of the MICB*004 allele (MICB*004 SUSC), and individuals with other genotypes (MICB*005 UNK). LPS stimulation of monocytes did not significantly increase MICA or MICB mRNA expression or surface expression in healthy individuals. However, when comparing groups, a high percentage of monocytes expressing MICA was observed in the MICA*008 HOM group, which may be explained by the anchoring of the truncated protein to the membrane via GPI. In contrast, a low percentage of monocytes expressing MICA on the surface was found in the MICA*002 MEM group, likely due to protein cleavage by metalloproteinases. Lastly, the profile of MICB positivity on monocyte surfaces was consistent with the literature, as individuals carrying the MICB*004 allele (MICB*004 SUSC group) exhibited a significant reduction in surface expression. Since MICA and MICB molecules are key mediators of immune activation or immune evasion in certain viral diseases and cancers, understanding their molecular profile in healthy individuals particularly in a genetically diverse population such as the Brazilian population could improve disease diagnosis and severity assessments while driving advancements in future immunotherapies.
Descrição
Palavras-chave
MICA, MICB, Monócitos, Ligantes, Ligante NKG2D, Monocytes, NKG2D ligand
Idioma
Português
Como citar
FERRAZ, Ingrid Miranda. Avaliação molecular de MICA e MICB em indivíduos saudáveis: quantificação de RNA e moléculas de membrana. Orientadora: Camila Ferreira Bannwart Castro. 2025. Dissertação (Mestrado em Biologia geral e aplicada) – Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista (UNESP), Botucatu, 2025.
