Avaliação de despolimerases fágicas contra Xanthomonas citri subsp. citri

Abstract

Este trabalho buscou investigar o potencial de despolimerases fágicas como alternativa no controle do cancro cítrico, doença de grande impacto econômico causada por Xanthomonas citri subsp. citri. A pesquisa concentrou-se na predição, clonagem, expressão e avaliação funcional de genes candidatos a despolimerases identificados em genomas de bacteriófagos associados a X. citri. Foram analisados 72 genomas fágicos por meio de um pipeline bioinformático que integrou ferramentas recentes de predição baseadas em aprendizado de máquina (PhageDPO, DePP e DepoScope) com análises de homologia estrutural (HHpred), modelagem tridimensional (AlphaFold) e busca de domínios conservados (Foldseek). A partir dessas etapas, foram selecionadas duas proteínas com alto grau de identidade estrutural e indícios de domínios de ligação a açúcares, escolhida a proteína XacP77_034 como alvo para clonagem e expressão. Na etapa experimental, fragmentos correspondentes ao gene completo (XP77G) e ao domínio de degradação de açúcares (XP77SD) foram clonados em vetores de expressão, seguidos de ensaios de produção em E. coli. Embora tenha sido possível obter proteínas recombinantes solúveis após protocolos de purificação e refolding, os testes funcionais contra linhagens de X. citri não demonstraram atividade de degradação de exopolissacarídeos, sugerindo que a proteína não apresenta função de despolimerase nas condições avaliadas. O resultado indica que, embora o pipeline bioinformático e a estratégia de expressão tenham se mostrado eficientes na seleção de candidatas e na superação de dificuldades de solubilidade, as ferramentas de predição atuais ainda apresentam limitações importantes, principalmente quanto aos seus bancos de dados de usados para o seu treinamento. Também é possível que a atividade enzimática dependa de condições específicas ou da presença de cofatores, fatores não investigados neste estudo. Nesse contexto, a principal contribuição deste trabalho foi a validação de um pipeline integrado para a prospecção de despolimerases, evidenciando, ao mesmo tempo, a necessidade de expandir os bancos de dados com validações funcionais em uma gama mais ampla de bacteriófagos, a fim de aumentar a confiabilidade das predições em estudos futuros.

This study aimed to investigate the potential of phage-derived depolymerases as an alternative strategy for the control of citrus canker, a phytopathology of major economic impact caused by Xanthomonas citri subsp. citri (X. citri). The research focused on the prediction, cloning, expression, and functional evaluation of candidate depolymerase genes identified in bacteriophage genomes associated with X. citri. A total of 72 phage genomes were analyzed through a bioinformatic pipeline that integrated recent machine learning–based prediction tools (PhageDPO, DePP, and DepoScope) with structural homology analyses (HHpred), three-dimensional modeling (AlphaFold), and conserved domain searches (Foldseek). From these steps, two proteins were selected due to their high structural identity and evidence of sugar-binding domains, with protein XacP77_034 chosen as the target for cloning and expression. In the experimental stage, fragments corresponding to the full gene (XP77G) and the sugar-degrading domain (XP77SD) were cloned into expression vectors and subjected to production assays in Escherichia coli. Although soluble recombinant proteins were obtained after purification and refolding protocols, functional tests against X. citri strains did not demonstrate exopolysaccharide-degrading activity, suggesting that the protein does not exhibit depolymerase function under the evaluated conditions. These findings indicate that, while the bioinformatic pipeline and expression strategy were effective in candidate selection and in overcoming solubility challenges, current prediction tools still present important limitations, particularly concerning the scope and representativeness of their training datasets. It is also possible that enzymatic activity depends on specific conditions or the presence of cofactors, factors not explored in this study. In this context, the main contribution of this work was the validation of an integrated pipeline for depolymerase prospecting, while simultaneously highlighting the need to expand databases with functional validations across a broader range of bacteriophages in order to improve the reliability of predictions in future studies.