Detecção e caracterização molecular de Bartonella spp. em flebotomíneos e maruins na Amazônia Brasileira

Abstract

O gênero Bartonella spp. engloba alfa-proteobactérias Gram-negativas intracelulares facultativas e fastidiosas que infectam eritrócitos e células endoteliais de diversos hospedeiros mamíferos, incluindo os seres humanos, podendo causar uma variedade de infecções agudas e crônicas. Tais microrganismos são agentes patogênicos tipicamente transmitidos por vetores, com a transmissão diretamente associada a diversos artrópodes hematófagos, como moscas, piolhos e pulgas. Os maruins (Diptera: Ceratopogonidae) do gênero Culicoides Latreille apresentam distribuição global, com 1.347 espécies descritas, sendo 151 no Brasil e 123 na Amazônia Brasileira. Diversas espécies de Culicoides são reconhecidas como vetores biológicos de agentes patogênicos que afetam mamíferos, aves e seres humanos. Flebotomíneos (Diptera: Psychodidae) apresentam relevância significativa na saúde pública, pois atuam como vetores de diversos agentes, incluindo vírus, bactérias e protozoários. O presente estudo teve como objetivo investigar a ocorrência molecular de Bartonella spp. em flebotomíneos e maruins coletados no Parque Nacional da Amazônia, no estado do Pará, Brasil. Para isso, foram analisados 297 espécimes de flebotomíneos, abrangendo 8 gêneros e 25 espécies, e 345 espécimes de Culicoides spp., representando 3 gêneros. DNA foi extraído individualmente de cada espécime utilizando TRIzol, e 85,2% (253/297) dos flebotomíneos e 86,7% (299/345) dos maruins foram positivos nos ensaios de PCR baseados no gene endógeno de invertebrados cox-1. Desses, 12,6% (32/253) dos flebotomíneos e 24% (72/299) dos maruins apresentaram resultados positivos nos ensaios de PCR quantitativo em tempo real, baseado na região intergênica 16S-23S rRNA (ITS) de Bartonella spp. Entre os espécimes positivos, destacam-se os seguintes resultados: 37/88 (42%) Culicoides foxi, 29/192 (15,1%) Culicoides hylas, 6/19 (31,5%) Culicoides leopoldoi, 7/32 (21,87%) Psychodopygus srie chagasi, 5/32 (15,62%) Psychodopygus série guyanensis, 3/32 (9,3%) Psychodopygus carrerai carrerai, 4/32 (12,5%) Psychodopygus ayrozai, 2/32 (6,25%) Psychodopygus paraensis, 2/32 (6,25%) Psychodopygus davisi, 1/32 (3,12%) Psychodopygus bispinosus, 1/32 (3,12%) Psychodopygus llanosmartinsi, 1/32 (3,12%) Psychodopygus amazonensis, 2/32 (6,25%) Nyssomyia richardwardi, 1/32 (3,12%) Nyssomyia shawi, 1/32 (3,12%) Nyssomyia anduzei e 1/32 (3,12%) Trichophoromyia sp. Ensaios adicionais de PCR convencional, baseados em 7 marcadores moleculares (gltA, nuoG, rpoB, ribC, groEL, ftsZ e pap31), foram realizados para a caracterização molecular. Os amplicons foram purificados por ExoSap™ e enviados para sequenciamento pelo método de Sanger. Culicoides foxi foi estatisticamente mais associado à positividade para Bartonella quando comparado com C. hylas e C. leopoldoi. Os espécimes de Culicoides coletados ao nível do solo foram mais associados à positividade para Bartonella spp. quando comparados com os coletados ao nível da copa das árvores. A análise filogenética baseada no gene gltA agrupou quatro sequências de Bartonella sp. obtidas (duas de C. foxi e duas de C. hylas) no mesmo sub-clado, agrupando-se com espécies associadas a ruminantes (B. bovis, B. capreoli, B. chomelii, B. melophagi e B. schoenbuchensis). Uma sequência do gene ribC de Bartonella sp. detectada em C. foxi foi posicionada no mesmo sub-clado de espécies associadas a gatos (B. koehlerae e B. henselae). As duas sequências do gene gltA de Bartonella spp. detectadas em Psychodopygus ilanosmartinsi e Psychodopygus serie chagasi foram posicionadas no mesmo clado de B. ancashensis, B. bacilliformis e linhagens ancestrais de Bartonella spp. previamente detectadas em flebotomíneos provenientes do México e do Brasil. Este estudo fornece a primeira evidência molecular de Bartonella spp. em Culicoides spp. no Brasil, bem como a primeira detecção molecular de Bartonella spp. em 10 espécies diferentes de flebotomíneos no país.

The genus Bartonella spp. includes Gram-negative facultative intracellular fastidious alpha-proteobacteria that infect erythrocytes and endothelial cells of various mammalian hosts, including humans, which can cause a variety of acute and chronic infections. These microorganisms are typically vector-borne pathogens, with transmission directly associated with various hematophagous arthropods such as flies, lice, and fleas. Biting midges (Diptera: Ceratopogonidae) of the genus Culicoides Latreille have a global distribution, with 1,347 described species, including 151 in Brazil and 123 in the Brazilian Amazon. Several Culicoides species are recognized as biological vectors of pathogens affecting mammals, birds, and humans. Phlebotominae sand flies (Diptera: Psychodidae) are of significant public health relevance as they act as vectors of various agents, including viruses, bacteria, and protozoa. This study aims to investigate the molecular occurrence of Bartonella spp. in Phlebotominae sand flies and biting midges collected in the Amazon National Park, in the state of Pará, Brazil. For this purpose, 297 sand fly specimens, representing 8 genera and 25 species, and 345 Culicoides spp. specimens, representing 3 genera, were analyzed. DNA was extracted individually from each specimen using TRIzol™; 85.2% (253/297) of phlebotomine and 86.7% (299/345) of biting midges were positive in PCR assays based on the invertebrate endogenous gene cox-1. Of these, 12.6% (32/253) sand flies and 24% (72/299) biting midges were positive in quantitative real-time PCR assays based on the 16S-23S rRNA intergenic region (ITS) of Bartonella spp. Among the positive specimens, the following results were observed: 37/88 (42%) Culicoides foxi, 29/192 (15.1%) Culicoides hylas, 6/19 (31.5%) Culicoides leopoldoi, 7/32 (21.87%) Psychodopygus srie chagasi, 5/32 (15.62%) Psychodopygus série guyanensis, 3/32 (9.3%) Psychodopygus carrerai carrerai, 4/32 (12.5%) Psychodopygus ayrozai, 2/32 (6.25%) Psychodopygus paraensis, 2/32 (6.25%) Psychodopygus davisi, 1/32 (3.12%) Psychodopygus bispinosus, 1/32 (3.12%) Psychodopygus llanosmartinsi, 1/32 (3.12%) Psychodopygus amazonensis, 2/32 (6.25%) Nyssomyia richardwardi, 1/32 (3.12%) Nyssomyia shawi, 1/32 (3.12%) Nyssomyia anduzei, and 1/32 (3.12%) Trichophoromyia sp. Additional conventional PCR assays based on 7 molecular markers (gltA, nuoG, rpoB, ribC, groEL, ftsZ, and pap31) were conducted for further molecular characterization. The amplicons were purified using ExoSap™ and submitted to Sanger sequencing. Culicoides foxi was statistically more associated with Bartonella positivity when compared to C. hylas and C. leopoldoi. Culicoides specimens collected at the ground level were more associated with positivity for Bartonella spp. when compared to those collected at the canopy. Phylogenetic analysis grouped four obtained Bartonella sp. gltA sequences (two from C. foxi and two from C. hylas) within the same sub-clade, clustering with ruminant associated species (B. bovis, B. capreoli, B. chomelii, B. melophagi and B. choenbuchensis. Bartonella sp. ribC sequence detected in C. foxi was positioned within the same sub-clade as cat-associated species (B. koehlerae and B. henselae). Phylogenetic inference grouped the two Bartonella spp. gltA sequences, detected in Psychodopygus ilanosmartinsi and Psychodopygus serie chagasi, in the same clade as B. ancashensis, B. bacilliformis, and ancient lineages of Bartonella spp. previously detected in sand flies from Mexico and Brazil. This study provides the first molecular evidence of Bartonella spp. in Culicoides spp. in Brazil, as well as the first molecular detection of Bartonella spp. in 10 different species of phlebotomines in this country.