Publicação: Padronização do teste dot blotting semi-quantitativo – aplicação no diagnóstico, seguimento e recaída da paracoccidioidomicose
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Data
Orientador
Mendes, Rinaldo Poncio 
Coorientador
Pós-graduação
Doenças Tropicais - FMB 33004064065P4
Curso de graduação
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Editor
Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Tipo
Tese de doutorado
Direito de acesso
Acesso aberto
Resumo
Resumo (inglês)
Introduction. Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic granulomatous disease caused by fungi of the genus Paracoccidioides. The identification of the etiologic agent in clinical specimens is the gold standard of its diagnosis. However, serological tests are also used with this objective, besides helping characterize the patient's severity and treatment follow-up. The double agar gel immunodiffusion test (DID) is considered the standard serological reaction in PCM; however, it has some limitations, such as its usual negativity in the cerebrospinal fluid, the lower sensitivity in cases of relapse, and immunosuppressed patients. Thus, the present study aimed to standardize the semi-quantitative dot blotting assay (DB) and the real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) to detect specific antibodies for Paracoccidioides brasiliensis and its DNA in PCM patients. Methodology. We evaluated 42 confirmed PCM patients at admission (pre-treatment) using DID and DB in serum samples and RT-PCR in total blood. For assessing cross-reactions, we included 42 healthy individuals as controls and 37 patients with other infectious diseases (tuberculosis, n=10; aspergillosis, n=10; histoplasmosis, n=10; cryptococcosis, n=7). The serological progress with the treatment was evaluated in eight patients: four with the acute/subacute form (AF) and four with the chronic form (CF) of PCM. The diagnosis of relapse was evaluated in 10 patients, pairing the results observed at admission and the moment of the relapse. The culture filtrate of the yeast phase of the Pb B.339 strain was the antigen used in the 1:8 dilution. The cut-off point was determined by the receiver operator characteristic (ROC) curve for DID as much as for DB. Results. The ROC curve showed that the cut-off was the undiluted serum for both DID and DB. DB results were available in five hours, while those of DID were available in four days. RT-PCR showed lower positivity (9.5%) than the serological tests DID (73.8%) and DB (78.6%) assay. The accuracy parameters of sensitivity, specificity, positive and negative predictive values, accuracy, and positive and negative likelihood ratios were 78.6%, 100.0%, 100.0%, 82.4%, 89.3%, 330, and 0.21 for DB, and 73.8%, 100.0%, 100.0% 79.2%, 86.9%, 310, and 0.26 for DID, respectively. Cross-reactions were not observed in serum samples of patients with histoplasmosis, tuberculosis, aspergillosis, and cryptococcosis in DB. The serum levels were always higher in DB than in DID. AF patients showed regression of DID titers to non-reagent and of DB titers to non-reagent or reagent undiluted in the studied period, differently of CF patients—their DB titers persisted to reagent while DID titers decreased to non-reagent. In the diagnosis of relapse, DB showed much higher sensitivity (90%) than DID (30%). Conclusions. Our findings demonstrated that: A. in the diagnosis at admission (pre-treatment), DB and DID presented similar accuracy, but DB was easier to perform and offered earlier results, while RT-PCR in blood samples had no indication; B. cross-reactions were not observed with serum from samples of patients with tuberculosis, aspergillosis, histoplasmosis, and cryptococcosis when the antigen was used in the dilution standardized; C. DB and DID were useful in the follow-up of PCM patients under antifungal treatment; D. DB presented much higher sensitivity than DID in the diagnosis of relapse, becoming its reaction of choice; E. based on these findings, the semi-quantitative DB assay should be introduced in the clinical laboratories.
Resumo (português)
Introdução: A paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica granulomatosa causada por fungos do gênero Paracoccidioides. A identificação do agente etiológico em espécimes clínicos é o padrão-ouro de seu diagnóstico, mas os testes sorológicos também são utilizados para esse fim, além de serem úteis na caracterização da gravidade do paciente e no seguimento do tratamento. A imunodifusão dupla em gel de ágar (IDD) é o teste considerado padrão na PCM, mas apresenta algumas limitações, como sua usual negatividade no líquido cefalorraquidiano, menor sensibilidade em casos de recaída e em pacientes imunossuprimidos. Assim, o objetivo deste estudo foi padronizar o teste dot blotting semi-quantitativo (DB) e a reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR) para identificação de anticorpos específicos e DNA de P. brasiliensis em pacientes com PCM. Metodologia. Foram estudados 42 pacientes com PCM confirmada, à admissão (pré-tratamento), utilizando-se IDD e DB em amostras de soro e qPCR em sangue total; 42 indivíduos saudáveis, como controles e 37 pacientes com outras doenças infecciosas (tuberculose - 10, aspergilose - 10, histoplasmose -10 e criptococose - 7), para avaliação de reações cruzadas. A evolução sorológica com o tratamento foi avaliada em oito pacientes, quatro com a forma aguda/subaguda (FA) e quatro com a forma crônica (FC). O diagnóstico de recaída foi avaliado em 10 pacientes, pareando-se os resultados observados em amostras coletadas à admissão e no momento da recaída. O filtrado de cultura da fase leveduriforme do Pb B.339, foi o antígeno utilizado, na diluição de 1:8. O ponto de corte (cutt-off) foi determinado pela curva receiver operator characteristic (ROC), tanto para IDD quanto para dot blotting (DB). Resultados. A curva ROC revelou que o cut off era o soro não diluído. Os resultados do DB estão disponíveis em cinco horas e os de IDD em quatro dias. A qPCR apresentou menor positividade (9,5%) que os testes IDD (73,8) e DB (78,6%). Os parâmetros de acurácia sensibilidade, especificidade, valores preditivos positivo e negativo, acurácia, razões de verossimilhanças positivo e negativo foram: 78,6%, 100,0%,100,0%, 82,4%, 89,3%, 330 e 0,21 para DB e 73,8%, 100,0%, 100,0%, 79,2%, 86,9%, 310 e 0,26 para IDD, respectivamente. Não foram observadas reações cruzadas com as amostras de soro de pacientes com histoplasmose, criptococose, tuberculose e aspergilose no ensaio de dot blotting. Os níveis séricos de DB foram mais elevados que os de IDD em pacientes com a FA em tratamento; a IDD evoluiu para não reagente, enquanto o DB para não reagente ou reagente em soro não diluído, no período avaliado. Os casos com a FC também exibiram níveis séricos mais elevados de DB que de IDD; no entanto, a IDD revelou níveis séricos que regrediram até nãoreagentes, enquanto os de DB persistiram reagentes, no período estudado. No diagnóstico de recaída, o DB mostrou-se muito mais sensível (90%) que a IDD (30%). Conclusões. A. no diagnóstico à admissão (pré-tratamento), DB e IDD se equivalem em acurácia, mas o DB é de realização mais simples e oferece resultados em tempo bem menor, enquanto a qPCR em sangue não tem indicação; B. não foram detectadas reações cruzadas com soro de pacientes com histoplasmose, aspergilose, criptococose e tuberculose quando o antígeno paracoccidióidico foi utilizado na diluição padronizada; C. DB e IDD são igualmente úteis no seguimento de pacientes com PCM em tratamento antifúngico D. o DB apresenta sensibilidade muito maior que a IDD no diagnóstico de casos de recaída, tornando-se o teste de escolha; E. esses achados sugerem a introdução do ensaio dot blotting em laboratórios clínicos de rotina.
Descrição
Palavras-chave
Paracoccidioidomicose, Dot blotting, Diagnóstico, Sorologia, Recaída
Idioma
Português
