Papel imunomodulador das beta-defensinas na resposta inflamatória nos tecidos periodontais

Abstract

A periodontite é uma doença inflamatória crônica, induzida por bactérias, que causa a destruição dos tecidos de suporte dentário. Os peptídeos antimicrobianos (PAMs) são importantes componentes da reposta imune inata e um dos principais mecanismos de defesa do sulco gengival, exibindo uma atividade antimicrobiana contra um amplo espectro de bactérias Gram-negativas e positivas, fungos e vírus, além regularem eventos inflamatórios iniciais e aumentarem a imunidade adaptativa. As defensinas, beta (HBD) e alfa-defensinas, são os PAMs predominantes em humanos. Estudos prévios mostraram que há uma diferença na regulação destes peptídeos em sítios com saúde e doença periodontal. Assim, os objetivos deste estudo foram: (1) avaliar o efeito do tratamento periodontal não-cirúrgico (TPNC) sobre os níveis de HBD-1, 2 e 3 no fluido crevicular gengival (FCG) de pacientes sistemicamente saudáveis com periodontite, (2) investigar o impacto do estímulo com HBD-2 em células epiteliais na expressão de IL-8, CCL20 e seus receptores CXCR1, CXCR2 e CCR6. Para o estudo clínico, 22 pacientes com boas condições de saúde geral, portadores de periodontite estágio III ou IV, grau B foram selecionados. Esses pacientes apresentavam pelo menos 4 sítios com profundidade de sondagem (PS) ≥ 4 mm, sangramento à sondagem (SS) e nível clínico de inserção (NCI) ≥ 4 mm em diferentes quadrantes. Os seguintes parâmetros clínicos foram avaliados: índice de placa visível (IPV), índice de sangramento gengival (ISG), PS, SS e NCI. Após uma semana do exame clínico, foi realizada coleta de FCG de dois sítios periodontalmente saudáveis, dois com perda de inserção moderada (PS = 4-5 mm, SS e NCI ≥ 4 mm) e dois com perda de inserção avançada (PS ≥ 6 mm, SS e NCI ≥ 6 mm). Em seguida, o tratamento periodontal nãocirúrgico foi realizado, por um único operador, por meio raspagem e alisamento radicular (RAR). Um mês após o término do TPNC, foram realizadas novas coletas do FCG dos sítios selecionados e reavaliação dos parâmetros clínicos. A quantificação dos níveis das HBDs no FCG foi realizada pela técnica ELISA sanduíche. Para o estudo in vitro, queratinócitos foram estimulados com duas diferentes doses de HBD2 e, então, os níveis dos mediadores inflamatórios e seus receptores foram detectados quanto à expressão gênica pela técnica RT-qPCR em tempo real e a quantificação proteica foi determinada pelo ensaio de ELISA sanduíche. Os dados de ambos os estudos foram tabulados e análises estatísticas apropriadas foram realizadas. No estudo clínico, os níveis de HBD-1 foram significativamente maiores no FCG após tratamento periodontal em comparação com os valores de baseline. Para as HBD-2 e 3 não foram detectadas diferenças nos níveis pré e pós-tratamento. Nos experimentos in vitro, o estímulo com HBD-2 aumentou significativamente a expressão gênica de IL8, CCL20 e seus receptores CXCR1, CXCR2 e CCR6 em queratinócitos. Estes resultados confirmam que as HBDs podem ter um efeito imunomodulador na etiopatogênese da periodontite.

Periodontitis is a chronic inflammatory disease, caused by bacteria, which causes the destruction of tooth-supporting tissues. Antimicrobial peptides (AMPs) are important components of the innate immune response and one of the main defense mechanisms of the gingival sulcus, exhibiting antimicrobial activity against a broad spectrum of Gram-negative and positive bacteria, fungi and viruses, in addition to regular early inflammatory events and increase adaptive immunity. The defensins, beta (HBD) and alpha-defensins, are the predominant AMPs in humans. Previous studies have shown that there is a difference in the regulation of these peptides in healthy and periodontal disease sites. Thus, the objectives of this study were: (1) to evaluate the effect of nonsurgical periodontal treatment (NCPT) on the levels of HBD-1, 2 and 3 in the gingival crevicular fluid (FCG) of systemically healthy patients with periodontitis, (2) investigate the impact of stimulation with HBD-2 in epithelial cells on the expression of IL-8, CCL20 and their receptors CXCR1, CXCR2 and CCR6. For the clinical study, 22 patients with good general health were selected, with stage III or IV periodontitis, grade B. These patients presented at least 4 sites with probing depth (PD) ≥4 mm, bleeding on probing (BOP) and clinical attachment level (CAL) ≥ 4 mm in different quadrants. The following clinical parameters were evaluated: visible plaque index (PI), gingival bleeding index (BI), PD, BOP and CAL. One week after the clinical examination, GCF was collected from two periodontally healthy sites, two with moderate attachment loss (PD = 4-5 mm, PD and CAL ≥ 4 mm) and two with advanced attachment loss (PD ≥ 6 mm, BOP and CAL ≥ 6 mm). Next, non-surgical periodontal treatment was performed, by a single operator, using scaling and root planing (SRP). One month after the end of the NCPT, new GCF collections were carried out from selected sites and clinical parameters were reassessed. Quantification of HBD levels in the GCF was performed using the sandwich ELISA technique. For the in vitro study, keratinocytes were stimulated with two different doses of HBD-2 and then the levels of inflammatory mediators and their receptors were detected in terms of gene expression using the real-time RT-qPCR technique and protein quantification was determined by the sandwich ELISA assay. Data from both studies were tabulated and the analyzes obtained were performed. In the clinical study, HBD-1 levels were significantly higher in GCF after periodontal treatment compared to baseline values. For HBD-2 and 3, differences in pre- and posttreatment levels were not blocked. In in vitro experiments, stimulation with HBD-2 significantly increased the gene expression of IL-8, CCL20 and their receptors CXCR1, CXCR2 and CCR6 in keratinocytes. These results confirm that HBDs may have an immunomodulatory effect on the etiopathogenesis of periodontitis.