Investigação do perfil metabólico de células dendríticas durante a eferocitose de células tumorais apoptóticas

Abstract

Dentro do microambiente tumoral (TME, do inglês tumor microenvironment), a apoptose é um dos principais padrões de morte celular mediante os tratamentos antitumorais convencionais, como a quimioterapia e radioterapia. A remoção dessas células mortas por fagócitos, denominada eferocitose, torna-se um processo prejudicial para a resposta antitumoral, uma vez que células dendríticas (DCs) e os macrófagos adquirem um perfil imunossupressor após a internalização e digestão de corpos apoptóticos tumorais. Frente a isso, o objetivo desse projeto foi investigar quais vias metabólicas sustentariam o perfil tolerogênico adquirido por DCs após a eferocitose dentro do TME. Como fonte de células apoptóticas tumorais foram utilizadas células Renca (Adenocarcinoma de córtex renal murino) tratadas com doxorrubicina, um inibidor das topoisomerases I e II, resultando em uma taxa de apoptose de cerca de 75%. Nossos dados demonstraram que a eferocitose de células Renca apoptóticas (Renca-ACs) resulta na geração de BMDCs com um perfil tolerogênico, observado pela redução na co-expressão de MHC II e CD86. Além disso, a internalização e digestão de corpos apoptóticos tumorais elevou significativamente a expressão de PD-L1, bem como a produção de IL-10 e IL-6, em comparação a condição controle. A deficiência de TIM-4, AXL e, principalmente, MertK, resultou em uma tendência de redução na MFI de PKH, sugerindo que BMDCs são menos hábeis em eferocitar subsequentes Renca-ACs. Utilizando inibidores farmacológicos, observamos que a produção de IL-10 e IL-6 durante a eferocitose de Renca-ACs depende da ativação da via glicolítica e da glutaminólise. Além disso, a produção de IL-6 parece também depender da síntese de ácidos graxos, e a produção de IL-10 da oxidação de ácidos graxos. Após a eferocitose de Renca-ACs, BMDCs sofrem um aumento na expressão gênica de enzimas glicolíticas como Glut1, Pkm2 e Ldha, e há uma tendência de aumento na expressão de Cpt1a, sugerindo também a envolvimento do metabolismo oxidativo no processo de eferocitose. Interessantemente, após 18h de co-cultura, foi observada uma diminuição da reserva e da capacidade glicolítica de BMDCs, sugerindo que a demanda glicolítica seja mais precoce e, em fases mais tardias, outras vias metabólicas podem estar envolvidas na manutenção do perfil tolerogênico dessas células. Ainda, a eferocitose de Renca-ACs mediada pelos receptores TIM4, AXL e MertK parecem estar envolvida na ativação do metabolismo glicolítico, visto que a ausência desses receptores reduziu a expressão de Glut1 e Ldha, comprovando que a interação com os receptores eferocíticos impacta diretamente na ativação das vias metabólicas envolvidas na geração do perfil tolerogênico de BMDCs adquirido durante a eferocitose de células tumorais apoptóticas. Em conjunto, os dados apresentados nesse trabalho sugerem que eferocitose de Renca-ACs gera BMDCs tolerogênicas, sendo esse perfil sustentado majoritariamente pelo metabolismo glicolítico e, em menor escala, pelo metabolismo oxidativo.

In the tumor microenvironment (TME), apoptosis is one of the main cell death pathways through conventional antitumor treatments, such as chemotherapy and radiotherapy. The clearance of these dead cells by phagocytes, termed efferocytosis, becomes a harmful process for the antitumor response because dendritic cells (DCs) and macrophages acquire an immunosuppressive profile after the internalization and digestion of tumor apoptotic cells. Therefore, this project aimed to investigate which metabolic pathways support the tolerogenic profile acquired by DCs after the efferocytosis within the TME. Renca cells (murine renal cortex adenocarcinoma) treated with doxorubicin, an inhibitor of topoisomerases I and II, were used as a source of tumor apoptotic cells, resulting in an apoptosis rate of 75%. Our data demonstrated that efferocytosis of apoptotic Renca cells (Renca-ACs) results in the generation of BMDCs with a tolerogenic profile, observed by the reduction in the co-expression of MHC II and CD86. Furthermore, the internalization and digestion of tumor apoptotic bodies significantly increased the expression of PD-L1, as well as the production of IL-10 and IL-6, compared to the control condition. Deficiency of TIM-4, AXL, and especially MertK, resulted in a reduction of PKH MFI, suggesting that BMDCs lower phagocytic ability. Using pharmacological inhibitors, we observed that the production of IL-10 and IL-6 during efferocytosis of Renca-ACs depends on the activation of glycolysis and glutaminolysis. In addition, IL-6 production also appears to depend on the fatty acid synthesis, and IL-10 production on fatty acid oxidation. After the efferocytosis of Renca-ACs, BMDCs had an increase in the expression of glycolytic enzymes such as Glut1, Pkm2, and Ldha, and we also observed a tendency for an increase in the expression of Cpt1a, suggesting the involvement of oxidative metabolism in the efferocytosis process. Interestingly, after 18 h of co-culture, a decrease in the reserve and the glycolytic capacity of BMDCs was observed, suggesting that the glycolytic demand is earlier and, in later phases, other metabolic pathways may be involved in the maintenance of the tolerogenic profile of these cells. Furthermore, the efferocytosis of Renca-ACs mediated by TIM-4, AXL, and MertK receptors seems to be involved in the activation of glycolytic metabolism, since the absence of these receptors reduced the expression of Glut1 and Ldha, proving that the interaction with efferocytic receptors impacts directly in the activation of metabolic pathways involved in the generation of the tolerogenic profile that BMDCs acquire during efferocytosis of apoptotic tumor cells. Taken together, these findings suggest that the efferocytosis of Renca-ACs generates tolerogenic BMDCs, that are supported mainly by glycolytic metabolism and, to a lesser extent, by oxidative metabolism.