Fitocistatinas CsinCPI-2 e CaneCPI-5 como moduladoras da regeneração óssea e da resposta imunoinflamatória periodontal: estudos in vitro e in vivo

Abstract

A regeneração de tecidos ósseos e periodontais em ambientes inflamatórios representa um dos principais desafios na odontologia regenerativa, exigindo estratégias terapêuticas capazes de modular simultaneamente processos celulares, imunológicos e moleculares. Nesse contexto, as fitocistatinas emergem como moléculas bioativas promissoras. No primeiro estudo, avaliou-se a incorporação da fitocistatina CaneCPI-5 em scaffolds de policaprolactona (PCL) recobertos com GelMA e seus efeitos sobre células-tronco mesenquimais da medula óssea (BMSCs). Ensaios in vitro demonstraram aumento da atividade osteogênica, evidenciado por maior atividade de fosfatase alcalina e formação de matriz mineralizada. Em modelo in vivo de defeito crítico em calvária de camundongos, BMSC pré-tratadas com CaneCPI-5 associada aos scaffolds promoveu aumento significativo da neoformação óssea. O segundo estudo investigou os efeitos da CaneCPI-5 sobre macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs) sob estímulo inflamatório. Os resultados demonstraram que a CaneCPI-5 modulou a resposta inflamatória ao reduzir a ativação das vias NF-κB p65 e p38 MAPK, diminuir a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e manter a expressão de Arg1, sem induzir uma polarização clássica para o fenótipo M2. Esses achados indicam que a CaneCPI-5 atua como um imunomodulador funcional, contribuindo para um perfil inflamatório mais equilibrado. No terceiro estudo, analisou-se o efeito da CaneCPI-5 sobre células do ligamento periodontal humano (hPDLCs) sob condições basais e inflamatórias induzidas por Filifactor alocis. Ensaios de RT-qPCR e mineralização demonstraram que a CaneCPI-5 preservou a atividade osteogênica dessas células mesmo sob estímulo inflamatório. Em modelo murino de periodontite induzida por ligadura, o tratamento com CaneCPI-5 resultou em menor perda óssea alveolar, maior densidade mineral óssea e alterações histológicas compatíveis com maior estabilidade tecidual periodontal. Por fim, o quarto estudo empregou análise proteômica do ligamento periodontal de ratos saudáveis e com periodontite experimental, utilizando espectrometria de massa associada à bioinformática. Foram identificadas alterações significativas no perfil proteico associadas à doença periodontal, incluindo proteínas já descritas na literatura e novos alvos potenciais, ampliando a compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos na patogênese periodontal e abrindo perspectivas para a identificação de novos biomarcadores e alvos terapêuticos. Em conjunto, os resultados demonstram que a CaneCPI-5 apresenta efeitos osteogênicos, imunomoduladores e regenerativos relevantes, atuando de forma integrada sobre células, tecidos e o microambiente inflamatório. Esses achados sustentam o potencial translacional da CaneCPI-5 como uma estratégia inovadora para aplicações em engenharia tecidual óssea e terapias regenerativas periodontais, além de reforçarem a importância da compreensão proteômica do microambiente periodontal para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas.

Bone and periodontal tissue regeneration in inflammatory environments remains a major challenge in regenerative dentistry, requiring therapeutic strategies capable of simultaneously modulating cellular, immunological, and molecular processes. In this context, phytocystatins have emerged as promising bioactive molecules. In the first study, the incorporation of the phytocystatin CaneCPI-5 into polycaprolactone (PCL) scaffolds coated with GelMA was evaluated, as well as its effects on bone marrowderived mesenchymal stem cells (BMSCs). In vitro assays demonstrated enhanced osteogenic activity, evidenced by increased alkaline phosphatase activity and mineralized matrix formation. In an in vivo murine critical-size calvarial defect model, BMSCs pretreated with CaneCPI-5 and combined with the scaffolds promoted a significant increase in new bone formation. The second study investigated the effects of CaneCPI-5 on bone marrow–derived macrophages (BMDMs) under inflammatory stimulation. The results showed that CaneCPI-5 modulated the inflammatory response by downregulating NF-κB p65 and p38 MAPK signaling, reducing reactive oxygen species (ROS) production, and maintaining Arg1 expression, without inducing a classical shift toward the M2 phenotype. These findings indicate that CaneCPI-5 acts as a functional immunomodulator, contributing to a more balanced inflammatory profile. In the third study, the effects of CaneCPI-5 on human periodontal ligament cells (hPDLCs) under basal and inflammatory conditions induced by Filifactor alocis were analyzed. RT-qPCR and mineralization assays demonstrated that CaneCPI-5 preserved the osteogenic activity of these cells even under inflammatory challenge. In a murine ligature-induced periodontitis model, treatment with CaneCPI-5 resulted in reduced alveolar bone loss, increased bone mineral density, and histological features consistent with improved periodontal tissue stability. Finally, the fourth study employed proteomic analysis of periodontal ligament tissues from healthy rats and rats with experimental periodontitis, using mass spectrometry combined with bioinformatics. Significant disease-associated alterations in the protein profile were identified, including proteins previously described in the literature as well as novel potential targets, expanding the understanding of the molecular mechanisms involved in periodontal pathogenesis and opening perspectives for the identification of new biomarkers and therapeutic targets. Taken together, these results demonstrate that CaneCPI-5 exerts relevant osteogenic, immunomodulatory, and regenerative effects, acting in an integrated manner on cells, tissues, and the inflammatory microenvironment. These findings support the translational potential of CaneCPI-5 as an innovative strategy for bone tissue engineering and periodontal regenerative therapies, while also reinforcing the importance of proteomic approaches to better understand the periodontal microenvironment and to guide the development of new therapeutic interventions.