Síntese, caracterização e avaliação de peptídeos intracelulares no sistema nervoso central de zebrafish (Danio rerio) em um modelo de Doença de Parkinson

Abstract

A doença de Parkinson é a segunda enfermidade neurodegenerativa mais comum no mundo, mas apesar do destaque em pesquisas recentes sua causa permanece desconhecida, não existe cura e os tratamentos disponíveis visam apenas o controle dos sintomas. Poucos estudos se concentram no papel de peptídeos na doença de Parkinson, que comprovadamente possuem função biológica em outras doenças neurodegenerativas. Um estudo prévio demonstrou que 9 de 118 peptídeos de cérebro de zebrafish apresentaram alteração em um modelo de 6-hidroxidopamina, neurotoxina mais comumente utilizada em estudos da doença. Neste contexto, este projeto de Mestrado visa compreender melhor o papel de 5 destes 9 peptídeos. A escolha dos peptídeos foi feita com base em suas proteínas precursoras, sendo elas: 1) Proteína de ácido graxo 7 (FABP7), que tem relação com a expressão de enzimas antioxidantes e proteção contra sinalização de apoptose; 2) Proteína ribossomal mitocondrial S36, que na literatura está relacionada à geração de NADH na respiração aeróbica, cuja redução tem correlação com doenças neurodegenerativas; 3) Proteína 1-B relacionada à MARCKS, que controla o movimento celular por meio da regulação do citoesqueleto de actina, entre outras funções; 4) Transportador de aminoácido excitatório 2 (EAAT2 - Excitatory Amino Acido Transporter 2), proteína com papel essencial na reciclagem de glutamato, o neurotransmissor mais abundante no cérebro de mamíferos; e 5) Timosina beta-4 (Tbeta4), peptídeo de 43 aminoácidos cuja principal função é regular a polimerização de actina, que é necessária para a organogênese e motilidade celular. Os peptídeos foram sintetizados quimicamente em fase sólida e caracterizados por cromatografia líquida de alta eficiência e espectrometria de massas. Foi realizada a espectroscopia de dicroísmo circular. Ensaios de viabilidade celular por MTT foram feitos em linhagens neuronais de camundongo (Neuro 2A) e humano (SHSY5Y). Ensaios de embriotoxicidade e comportamentais foram realizados com larvas de zebrafish wildtype, tal qual a quantificação de fluorescência de neurônios dopaminérgicos por meio de imunofluorescência. A linhagem transgênica de zebrafish Tg(Huc:gfp/NeuroD:rfp) foi usada para avaliar a integridade neuronal total. Os resultados indicam que o modelo transgênico e a imunofluorescência não foram os ideais para avaliar os danos causados pela 6-hidroxidopamina, nem os possíveis danos ou reparos dos peptídeos. Apesar disso, os resultados do ensaio de viabilidade celular mostram que nenhum dos cinco peptídeos apresentam citotoxicidade até a concentração de 512 µM. O ensaio comportamental indica que todos os peptídeos avaliados auxiliam na recuperação de movimento, e três peptídeos apresentaram resultados estatisticamente iguais aos do grupo controle, o que aponta para uma recuperação total do movimento. Mais estudos são necessários para compreender melhor o mecanismo de ação destes peptídeos e se eles são realmente um potencial aliado contra a doença de Parkinson.

Even though Parkinson’s disease is the second most common neurodegenerative disease worldwide, its cause remains unknown, there is no cure and all different treatment strategies available are able to only control the symptoms. Few studies focus on the role of peptides in Parkinson’s disease, which have been shown to have biological function in other neurodegenerative diseases. A previous study demonstrated that 9 out of 118 zebrafish brain peptides presented alterations in a 6-hydroxydopamine model, the most commonly used neurotoxin in studies of this disease. In this context, this Master’s project aims to better understand the role of 5 of these 9 peptides. The choice of peptides was made based on their precursor proteins, which are: 1) Fatty acid binding protein 7 (FABP7), which is related to the expression of antioxidant enzymes and protection against apoptosis signaling; 2) Mitochondrial ribosomal protein S36, which literature shows that is related to the generation of NADH in aerobic respiration, whose reduction is correlated with neurodegenerative diseases; 3) MARCKS-related protein 1-B, which controls cell movement through the regulation of actin cytoskeleton, among other functions; 4) Excitatory amino acid transporter 2 (EEAT2), a protein with an essential role in the recycling of glutamine, the most abundant neurotransmitter in the mammalian brain; and 5), Thymosin beta-4 (Tbeta4), a 43-amino acid peptide whose main function is to regulate actin polymerization, which is necessary for organogenesis and cell motility. The peptides were chemically synthesized in solid phase and characterized by high-performance liquid chromatography and mass spectrometry. Circular dichroism was performed in order to define the secondary structure of each peptide. MTT cell viability assays were performed in mouse (Neuro 2A) and human (SHSY5Y) neuronal lines. Embryotoxicity and behavioral assays were performed with wildtype zebrafish larvae. The quantification of dopaminergic neuron fluorescence by immunofluorescence was made using ImageJ. The transgenic zebrafish line TG(Huc:gfp/NeuroD:rfp) was used to evaluate total neuronal integrity. The results indicate that the transgenic model and immunofluorescence were not ideal to evaluate the damage caused by 6-hydroxydopamine, nor the possible damage or repair caused by treatment with the peptides. Despite this, the results of the cell viability assay show that none of the five peptides present cytotoxicity up to the concentration of 512 µM. The behavioral assay indicates that all the peptides have a role in the recovery of movement. Three peptides presented results statistically equal to those of the control group, which points to a full recovery of movement. Further studies are needed to better understand the mechanism of action of these peptides and whether they are truly a potential ally against Parkinson’s disease.