Estudo comparativo da ação de clivagem da Crotoxina e suas subunidades sobre vesículas DMPC E DMPG

Abstract

A Crotoxina (CTX) é a principal toxina presente no veneno da serpente Crotalus durissus terrificus, sendo composta de duas subunidades, uma não tóxica e não enzimática (CA), e outra tóxica (CB), sendo esta última uma fosfolipase A2 (PLA2). A crotoxina possui pronunciados efeitos neurotóxico e miotóxico e seu mecanismo de ação ainda é pouco compreendido. Para entender o processo de interação da CTX e de suas subunidades em membranas biológicas, foram preparadas vesículas extrusadas de dimiristoilfosfatidil colina (DMPC) e dimiristoilfosfatidil glicerol (DMPG), que são utilizadas para mimetizar estas membranas. Com o marcador fluorescente nitrobenzoxadiazol (NBD) incorporado às vesículas em diferentes regiões da cadeia hidrocarbônica da bicamada lipídica, medidas de espectroscopia de fluorescência foram realizadas a fim de obter informações sobre a interação membrana-proteína. Para isso, foram preparadas quatro diferentes amostras para observar o efeito das toxinas sobre os lipossomos compostos pelos dois lipídios acima mencionados (DMPC e DMPG): a vesícula pura, a vesícula interagindo com CA, a vesícula interagindo com a CB e a vesícula interagindo com a CTX. Através da intensidade máxima de emissão fluorescente analisamos a dependência deste parâmetro com a temperatura. Para a amostra contendo a CA nenhuma a diferença do máximo de emissão fluorescente foi observada em relação apenas em baixas temperaturas. Este resultado parece indicar um possível ancoramento da CA sobre a superfície do lipossomo, contrariamente ao mencionado na literatura que relata que a CA permanece em solução. Na amostra contendo CB, foi observada uma redução acentuada da intensidade fluorescente para todas as vesículas estudadas, indicando a ação fosfolipídica. Para a amostra contendo a CTX, o mesmo efeito foi observado para as vesículas de DMPG e nenhum efeito foi observado para as amostras de DMPC com a sonda NBD incorporada à superfície da membrana, conforme relatado na literatura. Entretanto, para a amostra de DMPC com a sonda NBD incorporada no centro da bicamada lipídica, foi observada uma redução da intensidade fluorescente. Por fim, medidas do decaimento fluorescente dos resíduos de triptofano (Trp) presentes nas proteínas também foram analisadas. Através do ajuste das curvas de decaimento foram obtidos três tempos de vida fluorescente bem como seus fatores pré-exponenciais. A análise destes parâmetros indica a inserção dos Trp em meio lipídico, o que confirma a interação das toxinas sobre as vesículas. Com base nos resultados acima mencionados, um possível modelo de interação da CTX sobre as vesículas é proposto. A CA presente na CTX ancora na superfície da membrana e a CB somente atuará de imediato sobre a membrana se existir uma área mínima ocupada por lipídio na matriz lipídica