Publication: Estudo comparativo da ação de clivagem da Crotoxina e suas subunidades sobre vesículas DMPC E DMPG
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Date
Authors
Advisor
Fernandez, Roberto Morato 
Fernandes, Carlos Alexandre Henrique
Coadvisor
Graduate program
Undergraduate course
Física Médica - ibb
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Type
Undergraduate thesis
Access right
Acesso restrito
Abstract
A Crotoxina (CTX) é a principal toxina presente no veneno da serpente Crotalus durissus
terrificus, sendo composta de duas subunidades, uma não tóxica e não enzimática (CA), e outra tóxica
(CB), sendo esta última uma fosfolipase A2 (PLA2). A crotoxina possui pronunciados efeitos neurotóxico
e miotóxico e seu mecanismo de ação ainda é pouco compreendido. Para entender o processo de interação
da CTX e de suas subunidades em membranas biológicas, foram preparadas vesículas extrusadas de
dimiristoilfosfatidil colina (DMPC) e dimiristoilfosfatidil glicerol (DMPG), que são utilizadas para
mimetizar estas membranas. Com o marcador fluorescente nitrobenzoxadiazol (NBD) incorporado às
vesículas em diferentes regiões da cadeia hidrocarbônica da bicamada lipídica, medidas de espectroscopia
de fluorescência foram realizadas a fim de obter informações sobre a interação membrana-proteína. Para
isso, foram preparadas quatro diferentes amostras para observar o efeito das toxinas sobre os lipossomos
compostos pelos dois lipídios acima mencionados (DMPC e DMPG): a vesícula pura, a vesícula
interagindo com CA, a vesícula interagindo com a CB e a vesícula interagindo com a CTX. Através da
intensidade máxima de emissão fluorescente analisamos a dependência deste parâmetro com a
temperatura. Para a amostra contendo a CA nenhuma a diferença do máximo de emissão fluorescente foi
observada em relação apenas em baixas temperaturas. Este resultado parece indicar um possível
ancoramento da CA sobre a superfície do lipossomo, contrariamente ao mencionado na literatura que
relata que a CA permanece em solução. Na amostra contendo CB, foi observada uma redução acentuada
da intensidade fluorescente para todas as vesículas estudadas, indicando a ação fosfolipídica. Para a
amostra contendo a CTX, o mesmo efeito foi observado para as vesículas de DMPG e nenhum efeito foi
observado para as amostras de DMPC com a sonda NBD incorporada à superfície da membrana, conforme
relatado na literatura. Entretanto, para a amostra de DMPC com a sonda NBD incorporada no centro da
bicamada lipídica, foi observada uma redução da intensidade fluorescente. Por fim, medidas do
decaimento fluorescente dos resíduos de triptofano (Trp) presentes nas proteínas também foram
analisadas. Através do ajuste das curvas de decaimento foram obtidos três tempos de vida fluorescente
bem como seus fatores pré-exponenciais. A análise destes parâmetros indica a inserção dos Trp em meio
lipídico, o que confirma a interação das toxinas sobre as vesículas. Com base nos resultados acima
mencionados, um possível modelo de interação da CTX sobre as vesículas é proposto. A CA presente na
CTX ancora na superfície da membrana e a CB somente atuará de imediato sobre a membrana se existir
uma área mínima ocupada por lipídio na matriz lipídica
Description
Keywords
Membranas-modelo, Crotoxina, Fluorescência
Language
Portuguese
