Efeito in vivo de inibidores do sistema de efluxo na virulência de Candida albicans resistente a fluconazol

Abstract

As bombas ou sistema de efluxo transportam de maneira ativa substâncias tóxicas para fora da célula e são um dos principais mecanismos de resistência microbiana. Determinadas substâncias podem ser usadas para inibir as bombas de efluxo presentes na membrana plasmática do fungo Candida albicans (Ca), como a curcumina (CUR) e o verapamil (VER). Os modelos de pesquisa em animais invertebrados têm surgido como um método alternativo. Tem sido demonstrado que a larva da cera maior (Galleria mellonella) é um modelo favorável para o estudo de infecções fúngicas. O objetivo deste estudo foi avaliar in vitro a interação entre os inibidores do sistema de efluxo (CUR e VER) com o fluconazol (FLU) e seu efeito in vivo em Ca resistente no modelo de G. mellonella. Foram utilizadas duas cepas de Ca, uma susceptível (ATCC 90028, CaS) e outra resistente ao fluconazol (ATCC 96901, CaR). Para determinar as menores concentrações dos inibidores do sistema de efluxo (VER e CUR) que apresentaram interação com o FLU, foi realizado o ensaio de tabuleiro, que foi analisado pelo índice de concentração inibitória fracional (FICI) e pela independência de Bliss. Foram testadas no modelo de G. mellonella os fármacos e suas concentrações que demonstraram reversão da resistência de CaR ao FLU previamente. Foram injetados, em cada larva, 10 µL do inóculo de CaS ou CaR e os fármacos (VER, FLU), isoladamente ou em combinação. As larvas foram incubadas e observada diariamente quanto a sobrevivência e recuperação fúngica. A sobrevivência de G. mellonella foi analisada por Kaplan-Meier e pelo teste de log- rank e a recuperação fúngica por ANOVA a 3 fatores (α = 5%). A combinação de VER + FLU resultou em ausência de interação FICI para CaS e CaR. Porém, pela análise de Bliss, foi verificado antagonismo para CaS e sinergismo para CaS. Para CUR e FLU, o FICI demonstrou sinergismo para CaS e não possível calcular para CaR. enquanto que a análise de Bliss resultou em sinergismo e antagonismo para CaS, a depender da concentração avaliada, e sinergismo para CaR. No ensaio com G. mellonella, não foi observada diferença entre os grupos tratados e não tratados com VER e FLU para CaS (p ≥ 0,235), enquanto que para CaR o tratamento isolado ou combinado com VER e FLU aumentou (p ≤ 0,012) a sobrevivência das larvas e reduziu (p < 0,001) a recuperação fúngica. Concluiu-se que os inibidores do sistema de efluxo demonstraram sinergismo com FLU e a combinação VER + FLU foi eficaz no combate à infecção por CaR.

Pumps or efflux systems actively transport toxic substances out of the cell and are one of the main mechanisms of microbial resistance. Certain substances can be used to inhibit efflux pumps present in the plasma membrane of the Candida albicans (Ca) fungus, such as curcumin (CUR) and verapamil (VER). Research models in invertebrate animals have emerged as an alternative method. The greater wax larva (Galleria mellonella) has been shown to be a favourable model for the study of fungal infections. The aim of this study was to evaluate in vitro the interaction between efflux system inhibitors (CUR and VER) with fluconazole (FLU) and their in vivo effect on resistant Ca in the G. mellonella model. Two strains of Ca were used, one susceptible (ATCC 90028, CaS) and the other resistant to fluconazole (ATCC 96901, CaR). To determine the lowest concentrations of the efflux system inhibitors (VER and CUR) that interacted with FLU, the tray assay was performed, which was analyzed by the fractional inhibitory concentration index (FICI) and by Bliss independence. Drugs and their concentrations that demonstrated reversion of CaR resistance to FLU previously were tested in the G. mellonella model. In each larva, 10 µL of the inoculum of CaS or CaR and the drugs (VER, FLU) were injected, alone or in combination. Larvae were incubated and observed daily for fungal survival and recovery. G mellonella survival was analyzed by Kaplan-Meier and long-rank test and fungal recovery by 3-way ANOVA (α = 5%). The combination of VER + FLU resulted in the absence of FICI interaction for CaS and CaR. However, by Bliss analysis, antagonism for CaS and synergism for CaS was verified. For CUR and FLU, FICI demonstrated synergism for CaS and not possible to calculate for CaR. While the Bliss analysis resulted in synergism and antagonism for CaS, depending on the concentration evaluated, and synergism for CaR. In the trial with G. mellonella, no difference was observed between the groups treated and not treated with VER and FLU for CaS (p ≥ 0,235), while for CaR, the treatment alone or combined with VER and FLU increased (p ≤ 0,012) the larvae survival and reduced (p < 0,001) fungal recovery. It was concluded that efflux system inhibitors demonstrated synergism was effective in combating CaR infection.