Avaliação da atividade antifúngica in vitro de chalconas e protocatecuatos incorporados no sistema nanoestruturado lipídico contra o complexo Paracoccidioides

Abstract

Paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica humana geograficamente limitada à América Latina. Paracoccidioides brasiliensis e P. lutzii são seus agentes etiológicos. A anfotericina B, itraconazol e fármacos sulfamídicos são utilizados para tratar esta doença, entretanto estes antifúngicos produzem toxicidade com o uso prolongado. As limitações dos antifúngicos atuais nas terapias de longa duração, bem como o aumento da incidência de infecções fúngicas sistêmicas ressaltaram a necessidade de descobrir e desenvolver novos medicamentos. O objetivo deste estudo foi investigar o efeito antifúngico de chalconas e de protocatecuatos incorporados em sistema nanoestruturado lipídico (SNL) contra P. brasiliensis e P. lutzii. A metodologia preconizada M27 -A2 (2002) do CLSI foi aplicada com adaptações para as espécies filogenéticas P. brasiliensis S1, S2 Pb18, Pb 02 e P. lutzii, Pb01-like. Os valores de CIM para as chalconas variaram de 31,25 a 0,12 μg/mL e para os protocatecuatos de 7,8 a 0,24 μg/mL. Os melhores valores de CIM contra os isolados de Paracoccidioides sp foram 0,12 μg/mL para a 2-hidroxichalcona (2-chalc) e para o protocatecuato de dodecila (dodecila) 0,24 μg/mL. Também foi avaliada a citotoxicidade através do método de MTT e sulforodamida B para a determinação da viabilidade celular (MRC5, NOK, A549 e HaCaT), frente as substâncias. A viabilidade celular para as chalconas variou de 77% a 97% e para os protocatecuatos de dodecila de 70% a 98%, sendo os melhores resultados para (2-chalc) com 97% e para o dodecila com 98%. A partir destes dados foram obtidos os índices de seletividade (IS) de 139 e 37,7, para (2-chalc) e o dodecila respectivamente. O SNL foi desenvolvido, avaliado e posteriormente foram incorporadas a 2-chalc e a dodecila. Através da caracterização físico química, realizada pelo analizador de partículas ZetaSizer Nano-ZS, foi mostrada que o potencial zeta variaram de -55 a -68 e o diâmetro das partículas que variaram de 148 a 156 nm. O índice de polidispersão (PDI) foi analizado e o valor obtido foi de 0,12 em média, mostrando que o sistema foi estável, homogênio e em escala nano. Desta forma foi avaliada a atividade antifúngica das substâncias incorporadas em SNL potencializando em 4 a 60 vezes a CIM, chegando a 100% a viabilidade celular e aumentando os IS de 3 a 100 vezes dependendo da substância. Posteriormente foi verificada a atividade dos protótipos antifúngicos selecionados no processo de adesão às matrizes laminina e fibronectina do isolado Pb18. Os resultados mostraram que a adesão foi inibida 51% e 67% para 2-chalc e dodecila respectivamente, sendo que após a incorporação destas no SNL essa porcentagem aumentou em aproximadamente 20% obtendo valores maiores que 80% de inibição da adesão. A melhor atividade anti-adesiva ocorreu com a dodecila nos ensaios de ligação à laminina. Para verificar o efeito dos protótipos antifúngicos incorporados e não incorporados no SNL realizou-se a análise sobre o proteôma total do fungo tratado e não tratado a fim de identificar as proteínas diferencialmente expressas e assim o provável mecanismo de ação. Inicialmente foi verificado o perfil total de proteínas do isolado Pb18 (S1) por eletroforese 2D e foram selecionados 240 spots diferencialmente expressos. Foi realizado o sequenciamento através MALDI TOF/TOF, onde se identificaram 80 proteínas que foram categorizadas na sua maioria relacionadas à funções metabólicas, produção de energia, ciclo celular e de membrana ligadas ao processo de adesão e essenciais para a sobrevivência do fungo. Desta forma podemos concluir que as chalconas e os protocatecuatos em especial a 2-chalc e dodecila possuem uma alta atividade antifúngica, baixa citotoxicidade, altos índices de seletividade que foram potencializados quando foram incorporados no SNL, tormando-se excelentes protótipos antifúngicos para o tratamento da paracoccidioidomicose.

Paracoccidioidomycosis (PCM) is a geographically limited to Latin America human systemic mycosis. Paracoccidioides brasiliensis and P. lutzii are etiological agents. A amphotericin B, itraconazole and sulfamidic drugs are used to treat this disease, however these antifungals produce toxicity with prolonged use. The limitations of current antifungal therapies in long duration as well as the increased incidence of systemic fungal infections emphasized the need to discover and develop new medicines. The purpose of this study, the antifungal effect of chalcones and protocatechuates incorporated into nanostructured lipid system (SNL) was investigated against P. brasiliensis and P. lutzii. The methodology proposed M27-A2 (2002) CLSI was applied with adaptations to the phylogenetic species P. brasiliensis S1, S2 Pb18, Pb 02 and P. lutzii, Pb01-like. MIC values for chalcones ranged from 31.25 to 0.12 μg/mL and the protocatechuates of 7.8 to 0.24 μg/mL. The best MIC values against Paracoccidioides spp isolates were 0.12 μg/mL to 2-hydroxychalcone (2-chalc) and the protocatechuate of dodecyl (dodecyl) 0.24 μg/mL. Cytotoxicity was also assessed by MTT method and sulphorodamide B for determination of cell viability (MRC5, NOK, HaCaT and A549) compared substances. Cell viability for chalcones ranged from 77% to 97% and for the protocatechuates of 70% to 98%, with the best results for (2-chalc) with 97% and 98% to dodecyl. From these data the selectivity index (SI) of 139 and 37.7 were obtained for (2-chalc) and dodecyl respectively. The SNL was developed, evaluated and subsequently were incorporated into 2-chalc and dodecyl. Through the physicochemical characterization performed by the analyzer Zetasizer Nano-ZS particles was shown that the zeta potential ranging from -55 to -68, and the diameter of the particles ranging 148-156 nm. The polydispersity index (PDI) was analyzed and the value obtained was 0.12 on average, indicating that the system was stable, homogeneous and nanoscale. Thus we evaluated the antifungal activity of substances incorporated into SNL leveraging in 4 to 60 increase the MIC, reaching 100% cell viability and increasing IS 3 to 100 depending on the substance. Subsequently we investigated the antifungal activity of prototypes selected in adherence to fibronectin and laminin matrices isolate Pb18 process. The results showed that the adhesion was inhibited 51% and 67% for 2- chalc and dodecyl respectively, and after the incorporation of these on SNL this percentage increased by approximately 20% obtaining values greater than 80% inhibition of adhesion. The best anti-adhesive activity occurred with dodecyl in binding assays to laminin. To evaluate the effect of incorporated and unincorporated antifungal prototypes on SNL was performed the analysis on the total proteome of treated and untreated yeast to identify proteins differentially expressed and thus the likely mechanism of action. It was initially verified the total protein profile of the isolate Pb18 (S1) by 2D electrophoresis and 240 differentially expressed spots were selected. Sequencing by MALDI TOF/TOF, where they identified 80 proteins that were categorized mostly related to metabolic functions, energy production, cell cycle and membrane linked to the accession process and essential for the survival of the fungus. Thus we conclude that chalcones and protocatechuates in particular 2-chalc and dodecyl have a high antifungal activity, low cytotoxicity, high levels of selectivity which were potentiated when they were incorporated in the SNL becoming prototypes excellent antifungal for the treatment of paracoccidioidomycosis.