Melhoramento da termoestabilidade da xilanase do fungo Thermoascus aurantiacus, expressa em E. coli, por evolução dirigida e desenho racional: Produção, purificação, caracterização bioquímica e biofísica da enzima

Abstract

A proposta inicial deste trabalho foi o melhoramento da termoestabilidade da xilanase do fungo T. aurantiacus (XynA_Ta), expressada em S. cerevisiae (XynA_Sc), a partir da construção anteriormente obtida em P. pastoris (xynA_Pp). Contudo, a reduzida expressão de XynA_Sc, aliada a duas mutações de aminóacidos, motivaram a reclonagem do gene de xynA_Ta em E. coli (xynA_Ec). O Capítulo 1 descreve o estudo da produção e caracterização de XynA_Sc, XynA_Pp e XynA_Ec, anterior as correções das mutações. Estas exibiram ótimos de expressão com 650, 5,8 e 815 U.mL-1, após 96 h e de atividade em pH 5-5,5 e 65-70 °C. XynA_Ec destacou-se com ampla faixa de estabilidade, de 40 a 85 °C, após 1h, e XynA_Pp mostrou 100% de atividade em pH 6-8, após 24 h. XynA_Sc e XynA_Pp apresentaram forte ativação em solventes orgânicos. A XynA_Sc foi inibida em concentrações superiores a 20 mg.mL-1 de substrato. O Capítulo 2 apresenta resultados da obtenção da forma nativa (corrigida) (XynAc_Ec) e de onze mutantes por MSD. Todas linhagens foram expressas, purificadas e fatores bioquímicos auxiliaram na seleção dos três mais termoresistentes. Estes foram caracterizados, juntamente com XynAc_Ec, frente a fatores biofísicos (CD) e estruturais (por homologia - 1TUXPDB). Destaque para o mutante H209N com maior termoestabilidade, atividade catalítica e Tm de 71,3 °C. O aumento na estabilidade térmica foi relacionado ao incremento de hélices curtas, pontes salinas e a carga positiva no core catalítico (trabalho publicado). O Capítulo 3 apresenta resultados da combinação in sílico dos três mutantes termoestáveis, com base em dados estruturais (homologia - 1TUX-PDB). Q158R / H209N / N257D exibiu maior conteúdo de interações salinas e menor RMSF. Portanto, XynA_Pp, XynA_Ec e H209N são enzimas potenciais para aplicação em bioprocessos; e estudos in sílico sugerem que mutante Q158R / H209N / N257D seja obtido in situ.

The initial purpose of this work was the improvement of xylanase thermal stability of fungus T. aurantiacus (XynA_Ta), expressed in S. cerevisiae (XynA_Sc) from the building previously obtained in P. pastoris (xynA_Pp). However, the reduced expression of XynA_Sc, combined with two mutations of amino acids, led to the recloning xynA_Ta gene in E. coli (XynA_Ec). Chapter 1 describes the study of the production and characterization of XynA_Sc, XynA_Pp and XynA_Ec, previous mutation corrections. These showed great expression with 650, 5.8 and 815 U.mL-1, after 96 h and activity at pH 5-5.5 and 65-70 °C. XynA_Ec displayed wide stability range from 40 to 85 °C, after 1h, and XynA_Pp showed 100% activity at pH 6-8, after 24 h. XynA_Sc and XynA_Pp exhibited stronger activation in organic solvents. The XynA_Sc was inhibited by concentrations greater than 20 mg.mL-1 of substrate. Chapter 2 describes the native correction (XynAc_Ec) and construction of eleven mutant obtained by the MSD. All strains were expressed, purified and biochemical factors helped in the selection of the three most heat resistant. These were characterized, along with XynAc_Ec, by biophysical (CD) and structural factors (homology - 1TUX-PDB). H209N mutant displayed higher thermal stability, catalytic activity and Tm of 71.3 °C. The increase in thermal stability was related to short helices content, salt bridges, and the positive charge in the catalytic core (published work). Chapter 3 presents results of in silico combination of the three thermostable mutants, based on structural data (homology - 1TUX-PDB). Q158R / H209N / N257D showed higher content of bridges interactions and lower RMSF. Therefore, XynA_Pp, XynA_Ec and H209N are potential enzymes for applied bioprocesses; and studies in silico suggest that mutant Q158R / H209N / N257D should be obtained in situ.