Papel da calreticulina no crosstalk entre células displásicas e macrófagos

Abstract

A calreticulina (CALR) é uma proteína multifuncional encontrada principalmente no lúmen do retículo endoplasmático. Sua principal função é atuar como uma proteína chaperona, auxiliando no dobramento de proteínas e na homeostase do cálcio, além de desempenhar papéis extracelulares, como adesão celular, reparo tecidual e modulação da resposta imunológica. No contexto tumoral, a CALR pode influenciar a polarização de macrófagos associados a tumores (TAMs). Adicionalmente, Mutações recorrentes no gene da CALR foram associadas a várias neoplasias, incluindo o tipo mieloproliferativo. O estudo teve como objetivo avaliar a expressão de calreticulina CALR e de marcadores associados a macrófagos por meio de abordagens in silico e ex vivo. Inicialmente, a análise in silico foi realizada utilizando bancos de dados públicos para investigar a expressão diferencial de CALR e de genes relacionados a TAM em amostras de tecidos normais e tumorais, bem como a correlação da expressão diferencial de CALR e os marcadores de TAM. Paralelamente, a abordagem ex vivo envolveu a coleta de amostras de tecido de pacientes diagnosticados com desordens potencialmente malignas orais (DPMO) e carcinomas espinocelulares orais (CECO) derivados de pacientes com lesão prévia de DPMO, submetidas a técnicas de sequenciamento de Sanger para análise de mutações associadas a CALR e imuno-histoquímica para avaliar a expressão de CALR e sua correlação com a densidade de macrófagos CD68+ e CD163+. Na análise in sílico foram avaliadas as expressões dos genes CALR, CD47, CD68, CD86, CD163 e HLA- DRB1, a qual revelou expressão significativamente aumentada de CD163 em HNSC comparados a tecidos normais adjacentes (p<0,01). Além disso, a expressão de CALR em HNSC foi significativamente e positivamente correlacionada com a expressão de CD47, CD68, CD86, CD163 e HLA-DRB1 em amostras de HNSC. Na análise de sequenciamento do exon 9 do gene da CALR foi confirmando a presença exclusiva do gene selvagem em todas as amostras analisadas. Finalmente, os resultados da análise imuno-histoquímica revelaram uma expressão significativamente elevada de CALR em amostras de leucoplasia verrucosa proliferativa (LVP) e CEC derivados de LVP em comparação com outrs DPMOs, incluindo líquen plano oral (LPO), lesão liquenoide oral (LLO) e leucoplasia (LO). Em relação ao perfil de macrófagos, foi observada uma maior densidade de células CD68+ e CD163+ nos grupos LPO e LVP em comparação com os outros grupos. Não houve associação entre a densidade de macrófagos e o grau de displasia epitelial ou história de transformação maligna. No entanto, foi identificada uma correlação positiva entre a densidade de CD68+ e CD163+ e a alta expressão de CALR apenas no grupo LVP. Os resultados deste estudo sugerem que a calreticulina (CALR) pode influenciar a resposta imunológica no microambiente tumoral, especialmente em lesões de leucoplasia verrucosa proliferativa (LVP), por meio de sua correlação com a densidade de macrófagos CD68+ e CD163+. Além disso, a ausência de mutações no exon 9 do gene da CALR indica que sua regulação pode ocorrer por mecanismos alternativos, contribuindo para a compreensão do papel dessa proteína na progressão das desordens potencialmente malignas orais.

Calreticulin (CALR) is a multifunctional protein primarily located in the lumen of the endoplasmic reticulum. Its primary functions include acting as a chaperone protein, assisting in protein folding and calcium homeostasis. Additionally, it plays extracellular roles, such as promoting cell adhesion, tissue repair, and immune response modulation. In the tumor context, CALR may influence the polarization of tumor- associated macrophages (TAMs). Furthermore, recurrent mutations in the CALR gene have been associated with various neoplasms, including myeloproliferative disorders. This study aimed to evaluate the expression of calreticulin (CALR) and macrophage- associated markers through in silico and ex vivo approaches. Initially, the in silico analysis utilized public databases to investigate the differential expression of CALR and TAM-related genes in normal and tumor tissues, as well as the correlation between CALR expression and TAM markers. In parallel, the ex vivo approach involved collecting tissue samples from patients diagnosed with potentially malignant oral disorders (PMODs) and oral squamous cell carcinomas (OSCCs) derived from PMODs. These samples underwent Sanger sequencing to analyze CALR-associated mutations and immunohistochemistry to assess CALR expression and its correlation with CD68+ and CD163+ macrophage density.In the in silico analysis, the expression levels of the genes CALR, CD47, CD68, CD86, CD163, and HLA-DRB1 were evaluated, revealing significantly elevated expression of CD163 in head and neck squamous cell carcinoma (HNSC) compared to adjacent normal tissues (p<0.01). Additionally, CALR expression in HNSC was significantly and positively correlated with the expression of CD47, CD68, CD86, CD163, and HLA-DRB1. Sequencing analysis of exon 9 of the CALR gene confirmed the exclusive presence of the wild-type gene in all analyzed samples. Finally, immunohistochemical analysis revealed significantly increased CALR expression in samples of proliferative verrucous leukoplakia (PVL) and OSCCs derived from PVL compared to other PMODs, including oral lichen planus (OLP), oral lichenoid lesions (OLL), and leukoplakia (OL). Regarding macrophage profiles, higher densities of CD68+ and CD163+ cells were observed in the OLP and PVL groups compared to the other groups. However, no association was found malignant transformation. A positive correlation between CD68+ and CD163+ density and high CALR expression was identified only in the PVL group.The findings of this study suggest that calreticulin (CALR) may influence immune responses in the tumor microenvironment, particularly in proliferative verrucous leukoplakia (PVL) lesions, through its correlation with CD68+ and CD163+ macrophage density. Furthermore, the absence of mutations in exon 9 of the CALR gene indicates that its regulation may occur through alternative mechanisms, contributing to a better understanding of the role of this protein in the progression of potentially malignant oral disorders.