Bioprospecção de Trichoderma antagônicos a Sclerotinia Sclerotiorum em área de produção orgânica

Abstract

Sclerotinia sclerotiorum é um patógeno que exige adequado manejo para minimizar as perdas na produção. O alto custo dos fungicidas químicos e seus efeitos deletérios ao ambiente e ao homem exigem a busca por novas opções de manejo da doença. Uma alternativa é a redução do potencial de inóculo pela ação de antagonistas que parasitam escleródios e apotécios. Na presente pesquisa foi realizado o isolamento e a seleção de Trichoderma spp. que ocorrem naturalmente sobre as estruturas de S. sclerotiorum, como estratégia para o desenvolvimento de possíveis agentes de biocontrole. Considerando que a supressividade natural é quebrada pelo uso de agrotóxicos, áreas orgânicas, portanto livres destes produtos foram escolhidas, fator importante para a seleção dos antagonistas. Foram coletados mil escleródios de S. sclerotiorum no campo de produção de feijão e enterrados em áreas orgânicas de pivô de feijão comum (Phaseolus vulgaris), pomar de jabuticaba (Plinia cauliflora), mata e bambuzal. Após um mês foram recuperados e plaqueados em meio Batata Dextrose Ágar (BDA). Quarenta isolados de Trichoderma foram obtidos a partir da colonização desses escleródios, em seguida purificados e preservados. Para quantificar a produção de esporos em meio de cultura, os isolados foram repicados em placa de Petri, e a suspensão obtida da lavagem foi avaliada pela contagem em câmara de Neubauer, o valor mínimo estipulado para a exclusão do isolado foi de 6x107 UFC/mL, em placa cheia. Para avaliar o potencial de parasitismo dos isolados, foi realizada a aplicação de uma suspensão de 1x107 esporos/mL sobre escleródios em solos contidos em caixa Gerbox, utilizando 36 isolados, previamente selecionados devido à produção de esporos/mL. Os escleródios foram plaqueados em meio seletivo Neon-S, sinalizando a sua viabilidade. Dezoito isolados inibiram em mais de 80% a germinação miceliogência dos escleródios, sendo que 16 inibiram totalmente. O teste foi repetido com os 18 isolados, sendo selecionados sete que apresentaram controle superior a 80%, sendo os de números: 4, 9, 12,13, 27, 36 e 44, os cinco primeiros foram obtidos da área de pivô de feijão, o isolado 36 da área de mata e o 44 da área do pomar de jabuticaba. Os isolados 4, 9 e 27 foram identificados como Trichoderma yunnanense, isolado 12 como Trichoderma atrobrunneum, isolado 13 como Trichoderma pubescens, isolado 44 como Trichoderma hamatum e o isolado 36 continua em análise. O teste de cultura pareada in vitro foi utilizado para a verificação de antagonismo de Trichoderma spp. contra S. sclerotiorum, a taxa de inibição quantificada pelo software ImageJ e as médias submetidas ao teste de Tukey 5%. Neste teste os seis que inibiram mais de 70% foram: 1, 13, 27, 44, 20 e 7; e com mais de 80% de inibição, os isolados 4 e 46. O teste também foi utilizado para quantificação da formação de escleródios sob exposição dos antagonistas. Os isolados 4 e 13 foram os únicos que impediram a formação de escleródios em placa, já com os isolados 6, 7, 9 e 16 houve a formação de 1,5 escleródio/placa. O isolado 4 se destacou em todos os testes, seguido dos isolados 13, 27 e 44, mostrando potencial de parasitismo dos escleródios, inibição de crescimento do patógeno e formação de escleródios.

Sclerotinia sclerotiorum is a pathogen that requires thorough management to minimize reduction in the production. The high cost of chemical fungicides and their effects on the enviroment and humans demands investigations for purposing new disease management options. One alternative is the reduction of inoculum potential by the action of antagonists that parasitize sclerotia and apothecia. In this study, Trichoderma spp. that occur naturally on the structures of S. sclerotiorum were isolated and selected as a strategy for the development of possible biocontrol agents. Considering that natural suppressiveness is broken by the use of chemical pesticides we selected the organic areas, which are free from these products. One thousand sclerotia of S. sclerotiorum were collected at the bean crop field and buried in organic bean (Phaseolus vulgaris) pivot areas, forest, Brazilian berries (Plinia cauliflora) and bamboo groves. After one month, they were recovered and transferred on Potato Dextrose Agar (BDA) medium in the laboratory. Forty Trichoderma isolates were obtained from the colonization of these sclerotia, then purified and preserved. To quantify the spore production in culture medium, the isolates were multiplied on Petri dishes, and the suspension obtained from the washing was evaluated by counting in a Neubauer chamber. The minimum value stipulated for the exclusion of the isolate was 6x107 CFU/mL, in a full plate. Only 2 isolates had a lower concentration and were discarded from the study. To evaluate the potential of parasitism of the isolates, a suspension of 1x107 spores/mL was applied in sclerotia in soil contained in a Gerbox box, using 36 isolates, previously selected due to the production of spores/mL. The sclerotia were plated on Neon-S selective medium, signaling their viability. Eighteen isolates inhibited mycelial germination of sclerotia by more than 80%, and 16 showed complete inhibition. The test was repeated with the 18 isolates, and seven that showed control greater than 80% were selected, namely: 4, 9, 12, 13, 27, 36 and 44. The first five were obtained from the bean pivot area, isolate 36 from the forest area and isolate 44 from the Brazilian berries’ orchard area. Isolates 4, 9 and 27 were identified as Trichoderma yunnanense, isolate 12 as Trichoderma atrobrunneum, isolate 13 as Trichoderma pubescens, isolate 44 as Trichoderma hamatum and isolate 36 remains under analysis. The in vitro paired culture test was used to evaluate the antagonism of Trichoderma spp. against S. sclerotiorum, the inhibition rate was quantified by ImageJ software, and the means subjected to the 5% Tukey test. In this test, the six isolates that inhibited more than 70% were: 1, 13, 27, 44, 20 and 7; and with more than 80% inhibition, isolates 4 and 46. The test was also used to quantify the formation of sclerotia under exposure to the antagonists. Isolates 4 and 13 were the only ones that prevented the formation of sclerotia in Petri dishes, while isolates 6, 7, 9 and 16 formed 1.5 sclerotia/dishes. Isolate 4 stood out in all tests, followed by isolates 13, 27 and 44, showing potential for parasitism of sclerotia, inhibition of pathogen growth and formation of sclerotia.