Avaliação do potencial pró-osteogênico da fitocistatina CaneCPI-5 em células mesenquimais indiferenciadas

Abstract

Defeitos ósseos intraorais compreendem condições clínicas causadas por diferentes fatores, dentre eles a periodontite e a peri-implantite. Estas são doenças de caráter inflamatório crônico associadas com a disbiose da microbiota oral, que acometem os tecidos periodontais e peri-implantares, resultando em perda progressiva do osso de suporte. A utilização de produtos naturais para o tratamento de condições patológicas intraorais tornou-se um alvo crescente de estudos. As fitocistatinas são derivadas de diferentes plantas, apresentando atividade inibitória de cisteíno proteases. Além da inibição das cisteína catepsinas, alguns estudos demonstram que as cistatinas podem apresentar efeito pró-osteogênico. Dentre as fitocistatinas isoladas, destacamos a CaneCPI-5, ou canacistatina, derivada da cana de açúcar. O objetivo do presente estudo foi avaliar in vitro o efeito pró-osteogênico da fitocistatina CaneCPI-5. Para isso, foram utilizadas células primárias mesenquimais indiferenciadas, derivadas da medula óssea de camundongos (BMSCs), divididas em 4 grupos experimentais: controle, meio osteogênico (OM), CaneCPI-5 e OM+CaneCPI-5. Foi realizada análise de viabilidade e proliferação celular através do ensaio Alamar Blue®, para detecção de atividade metabólica celular das BMSCs sob estímulos de OM e CaneCPI-5. Para avaliar a diferenciação osteoblástica, após 24 horas de estímulos as células foram coletadas para análise de expressão gênica de Bglap, Col1a2, Runx2 e ALP através de RT-qPCR. Os dados obtidos foram tabulados e realizado análise estatística (ANOVA/Tukey, p≤0,05). Na análise de viabilidade e proliferação celular, observou-se que as BMSC se mantêm viáveis com os estímulos no período analisado. Houve aumento significativo na expressão gênica de Runx2 e ALP nos grupos com estímulo de CaneCPI-5 (associados ou não a OM) comparados ao grupo controle e OM. O grupo OM+CaneCPI-5 apresentou maior expressão gênica de Bglap e Col1a2 comparado ao grupo controle. Conclui-se que a fitocistatina CaneCPI-5 oferece um microambiente favorável para sobrevivência e diferenciação celular, além de aumentar a expressão de genes relacionados a osteogênese, sugerindo seu potencial efeito na formação óssea.

Intraoral bone defects encompass clinical conditions caused by various factors, including periodontitis and peri-implantitis. These are chronic inflammatory diseases associated with dysbiosis of the oral microbiota, affecting periodontal and peri-implant tissues and resulting in progressive loss of supporting bone. The use of natural products for treating intraoral pathological conditions has become a growing focus of research. Phytocystatins, derived from different plants, exhibit inhibitory activity against cysteine proteases. In addition to inhibiting cysteine cathepsins, some studies have shown that cystatins may exhibit pro-osteogenic effects. Among the isolated phytocystatins, CaneCPI-5, or canecystatin, derived from sugarcane, stands out. The aim of the present study was to evaluate the in vitro pro-osteogenic effect of the phytocystatin CaneCPI-5. For this purpose, primary undifferentiated mesenchymal cells derived from the bone marrow of mice (BMSCs) were used, divided into four experimental groups: control, osteogenic medium (OM), CaneCPI-5, and OM+CaneCPI-5. Cell viability and proliferation were analyzed using the Alamar Blue® assay to detect the metabolic activity of BMSCs under OM and CaneCPI-5 stimuli. To assess osteoblastic differentiation, cells were collected after 24 hours of stimulation for gene expression analysis of Bglap, Col1a2, Runx2, and ALP using RT-qPCR. The data were tabulated and subjected to statistical analysis (ANOVA/Tukey, p≤0.05). The cell viability and proliferation analysis showed that BMSCs remained viable under the tested stimuli during the analyzed period. A significant increase in Runx2 and ALP gene expression was observed in groups stimulated with CaneCPI-5 (with or without OM) compared to the control and OM groups. The OM+CaneCPI-5 group exhibited higher Bglap and Col1a2 gene expression compared to the control group. In conclusion, the phytocystatin CaneCPI-5 provides a favorable microenvironment for cell survival and differentiation, in addition to increasing the expression of osteogenesis-related genes, suggesting its potential effect on bone formation.