Efeitos da estimulação sequencial e suplementação com neurorregulina durante a MIV sobre a progressão meiótica e a produção embrionária

Abstract

A maturação in vitro (MIV) é uma técnica de reprodução assistida empregada na pecuária e na medicina reprodutiva. O uso de fatores intrafoliculares durante a MIV tem sido investigado para estimular e modular a cascata de maturação de maneira mais fisiológica e melhorar os resultados da produção embrionária. Esse estudo teve como objetivo aprimorar um sistema de maturação oocitária já estabelecido em nosso laboratório, o Sistema Folicular (SF), utilizando os indutores FSH e ampirregulina (AREG) de maneira sequencial (SFseq), para promover uma ativação mais fisiológica da cascata de maturação. Avaliou-se também a suplementação com neurorregulina (NRG1) na primeira etapa do SFseq, um EGF-like que atua modulando a ativação da cascata de maturação. Complexos cumulus-oócitos (COCs) obtidos de ovários de abatedouros foram submetidos a MIV durante 6, 9 e 22h para avaliar a maturação nuclear (experimento 1) ou durante 24h para a produção embrionária (experimento 2) com os tratamentos: FSH, SF, SFseq e SFseq+N. COCs alocados no grupo SFseq e SFseq+N foram primeiramente cultivados por 6h em meio sem adição de AREG e NRG1 (SFseq) ou somente sem adição de AREG (SFseq+N), seguido de cultivo em meio SF completo. No experimento 1, ao final dos períodos estipulados acima, os oócitos foram desnudos e corados com Hoechst para avaliar a progressão meiótica. No experimento 2, os COCs maturados foram submetidos à fertilização in vitro e cultivo in vitro. No terceiro dia do cultivo, a clivagem embrionária foi analisada e ao final de 7 dias de cultivo, a produção de blastocistos, o grau de desenvolvimento e número de células embrionárias foram analisados. Os dados foram comparados por ANOVA ou Kruskal-Wallis e as diferenças foram consideradas significativas quando P ≤ 0,05. Os resultados mostraram que a ativação sequencial (SFseq e SFseq+N) modulou a maturação nuclear nas primeiras 6 horas sem comprometer a progressão para metáfase II. Quanto à produção embrionária, a adição de NRG1 nas fases iniciais do tratamento SFseq reduziu a taxa de blastocisto. No entanto, não houve diferenças no número total de células nos blastocistos produzidos. Os dados indicam que a estratégia sequencial diminuiu a velocidade de maturação nuclear inicial, mas parece não beneficiar a aquisição de competência para o desenvolvimento embrionário no modelo proposto. A continuidade dos estudos, com maior número de réplicas experimentais, é importante para a confirmação desses resultados, considerando também a avaliação de variações no tempo de exposição aos tratamentos e do período total da maturação.

In vitro maturation (IVM) is an assisted reproduction technique used in livestock and reproductive medicine. The use of intrafollicular factors during IVM has been investigated to stimulate and modulate the maturation cascade in a more physiological way and improve embryo production outcomes. This study aimed to improve an oocyte maturation system already established in our laboratory, the Follicular System (FS), using the FSH and amphirregulin (AREG) inducers in a sequential manner (SFseq), to promote a more physiological activation of the maturation cascade. Supplementation with neuregulin (NRG1) in the first stage of SFseq, an EGF-like that acts by modulating the activation of the maturation cascade, was also evaluated. Cumulus-oocyte complexes (COCs) obtained from slaughterhouse ovaries were submitted to IVM for 6, 9 and 22 h to evaluate nuclear maturation (experiment 1) or for 24 h for embryo production (experiment 2) with the following treatments: FSH, SF, SFseq and SFseq+N. COCs allocated to the SFseq and SFseq+N groups were first cultured for 6 h in medium without the addition of AREG and NRG1 (SFseq) or only without the addition of AREG (SFseq+N), followed by culture in complete SF medium. In experiment 1, at the end of the periods stipulated above, the oocytes were denuded and stained with Hoechst to evaluate meiotic progression. In experiment 2, the matured COCs were submitted to in vitro fertilization and in vitro culture. On the third day of culture, embryo cleavage was analyzed and, at the end of 7 days of culture, blastocyst production, degree of development and number of embryo cells were analyzed. Data were compared by ANOVA or Kruskal-Wallis and the differences were considered significant when P ≤ 0.05. The results showed that sequential activation (SFseq and SFseq+N) modulated nuclear maturation in the first 6 hours without compromising progression to metaphase II. However, there were no differences in the total number of cells in the blastocysts produced. The data indicate that the sequential strategy decreased the initial nuclear maturation rate, but does not seem to benefit the acquisition of competence for embryonic development in the proposed model. The continuity of the studies, with a greater number of experimental replicates, is important for the confirmation of these results, also considering the evaluation of variations in the time of exposure to the treatments and the total period of maturation.