Novas abordagens em citometria de fluxo: o uso do herbário como fonte de material para o estudo do tamanho do genoma em Orchidaceae

Abstract

A família Orchidaceae é amplamente representada no Brasil. No entanto, dados citogenéticos de espécies neotropicais — especialmente informações sobre tamanho do genoma — permanecem escassos, limitando inferências evolutivas na região. Considerando as dificuldades logísticas de coleta de múltiplos indivíduos vivos em campo, este trabalho teve como objetivo avaliar a viabilidade do uso de polínias preservadas em exsicatas de herbário como fonte alternativa de material para determinação do tamanho do genoma por citometria de fluxo. Foram analisadas polínias removidas de exsicatas de Mormolyca rufescens e Coelogyne trinervis, além de exemplares de outros gêneros da subtribo Maxillariinae, submetidos a diferentes tempos de estocagem (três meses, seis meses e superior a um ano), bem como à secagem em sílica. O estudo também implementou adaptações no protocolo de extração de núcleos utilizando tampão Ebihara e testou a eficácia da adição de β-mercaptoetanol na preservação do DNA. Os resultados mostraram que polínias armazenadas por mais de um ano apresentaram valores de tamanho de genoma discrepantes e inviáveis, indicando degradação do material genético. Amostras com menor tempo de estocagem (três e seis meses) exibiram maior viabilidade, e a adição de β-mercaptoetanol proporcionou histogramas de melhor qualidade e redução do coeficiente de variação (CV). Ainda assim, divergências nos valores absolutos de tamanho de genoma sugerem a persistência de processos oxidativos ou interferências na ligação do fluorocromo em polínias preservadas em exsicatas. Conclui-se que, embora o método apresenta limitações para a estimativa precisa do tamanho do genoma em materiais de longa estocagem, ele estabelece bases promissoras para o uso de coleções de herbário em análises citogenéticas, como a determinação de ploidia, ressaltando a necessidade de futuras otimizações metodológicas envolvendo novos antioxidantes e tampões.

The Orchidaceae family is broadly represented in Brazil. However, cytogenetic data for Neotropical species—especially information on genome size—remain scarce, limiting evolutionary inferences in the region. Considering the logistical challenges of collecting multiple live individuals in the field, this study aimed to assess the feasibility of using pollinia preserved in herbarium specimens as an alternative source of material for genome size estimation via flow cytometry. Pollinia removed from herbarium specimens of Mormolyca rufescens and Coelogyne trinervis, as well as samples from other genera within the subtribe Maxillariinae, were analyzed under varying storage periods (three months, six months, and longer than one year) and under silica-drying conditions. The study also implemented adjustments to the nuclear extraction protocol using Ebihara buffer and evaluated the effectiveness of adding β-mercaptoethanol for DNA preservation. The results showed that pollinia stored for more than one year yielded inconsistent and unreliable genome size estimates, indicating degradation of genetic material. Samples with shorter storage times (three and six months) exhibited greater viability, and the addition of β-mercaptoethanol produced higher-quality histograms and reduced coefficients of variation (CV). Nevertheless, discrepancies in absolute genome size values suggest ongoing oxidative processes or interference with fluorochrome binding in pollinia preserved on herbarium sheets. In conclusion, although the method presents limitations for the accurate estimation of genome size in long-stored material, it provides promising foundations for the use of herbarium collections in cytogenetic analyses such as ploidy determination, highlighting the need for further methodological optimizations involving new antioxidants and buffers.