Seleção e validação de genes de referência em condições de fotoperíodo artificial para indução do florescimento em Cana-de-açúcar

Abstract

A cana-de-açúcar é uma cultura de alto impacto no agronegócio do Brasil, principalmente pela produção de açúcar, álcool e bioeletricidade. O florescimento é um processo fisiológico importante para os programas de melhoramento genético na realização de cruzamentos, e indesejável aos produtores por proporcionar, em algumas cultivares, perda de acúmulo de sacarose prejudicando diretamente o rendimento dos canaviais. Desta forma, o conhecimento da expressão dos genes envolvidos no processo de indução (transição do meristema vegetativo para reprodutivo) é de extrema importância para o desenvolvimento de novas cultivares de cana-de-açúcar. Entretanto, o estudo da expressão de genes via PCR quantitativo em tempo (RT-qPCR) requer a escolha correta de genes de referência para normalizar a expressão dos genes alvos e, consequentemente, proporcionar a sua correta interpretação. O objetivo deste trabalho foi identificar genes de referência estáveis para validação de genes diferencialmente expressos via RT-qPCR. A partir de um experimento de RNA-Seq que investigou genes envolvidos na indução floral fotoperiódica na cultivar comercial de cana-de-açúcar IACSP96-7569 foi selecionado os genes alvos para validação. Oito diferentes candidatos a genes de referência (UBQ1, UBQ2, RPL, GAPDH, 25SrRNA1, TUB, EF1-α e TIPS-41) foram testados sob dois tratamentos fotoperiódicos (dia curto e dia longo), em dois momentos de desenvolvimento (correspondentes aos estágios iniciais da indução floral e formação de primórdios florais) em dois tecidos foliares (folha madura e folha imatura). A estabilidade dos candidatos a genes de referência em todas as condições foi avaliada pelos algoritmos NormFinder, BestKeeper e RefFinder e mostrou que UBQ1 e TUB foram os genes de referência mais estáveis. O par de genes de referência mais estável (UBQ1/TUB) e o menos estável (GAPDH/ 25SrRNA1) foi utilizado para normalizar a expressão de dois transcritos identificados como expressos diferencialmente a partir dos dados de RNA-Seq, PIL5 (“PHYTOCHROME INTERACTING FACTOR 3-LIKE 5”) e LHP1 (“LIKE HETEROCHROMATIN PROTEIN 1”) evidenciando os seus efeitos na resposta da expressão destes alvos. A comparação entre os resultados de expressão diferencial para estes dois alvos via RNA-Seq (FPKM) e RT-qPCR mostrou certa divergência sinalizando a importância da utilização de genes de referência adequados para validar os resultados do RNA-Seq. Além da seleção e validação de genes de referência, 13 genes alvos incluindo dois transcritos de função desconhecida foram avaliados via RT-qPCR, bem como a expressão do gene ortólogo ao FLOWERING LOCUS T (FT) ao longo de seis tempos de coleta em folha madura. A seleção e validação de genes de referência foram essenciais para a correta interpretação dos dados de RT-qPCR e servirão como um guia nos estudos de florescimento em cana-de-açúcar, especialmente aqueles voltados para a indução fotoperiódica da floração.

Sugarcane is an important economic crop worldwide, highlighting in Brazil's agribusiness mainly for sugar, ethanol, and bioelectricity production. The flowering induction process, marked by the apical meristem transition from vegetative to reproductive stage, negatively impacts sugarcane production and quality traits. Despite its importance, the knowledge of the genes involved in the flowering induction pathway as well as its expression in the beginning of the induction process is still scarce in this high complex polyploid crop. Reverse transcription quantitative real-time (RT-qPCR) is the most used technique for gene expression analysis and requires the selection of reliable reference genes to normalize the expression of target genes and for correct interpretation of the RT-qPCR data. The aim of this work was to identify stable reference genes for RT-qPCR validation of differentially expressed genes previously identified in a RNA-Seq experiment investigating genes involved with photoperiodic floral induction in the commercial sugarcane cultivar IACSP96-7569. Eight different candidate reference genes (UBQ1, UBQ2, RPL, GAPDH, 25SrRNA1, TUB, EF1-α, and TIPS-41) were tested under two photoperiodic treatments (short day and long day), at two developmental time points (corresponding to the early stages of floral induction and floral primordia formation) in two leaf tissues (mature leaf and spindle leaf). The stability of the candidate reference genes in all conditions was evaluated with NormFinder, BestKeeper, and RefFinder algorithms and showed that UBQ1 and TUB were the most stable reference genes. The most stable reference gene pair (UBQ1/TUB) and the least stable pair (GAPDH/25SrRNA1) were used to normalize the expression of two transcripts identified as being differentially expressed from our RNA-Seq data: PIL5 (PHYTOCHROME INTERACTING FACTOR 3-LIKE 5) and LHP1 (LIKE HETEROCHROMATIN PROTEIN) highlighting its effect on the expression of the targets. The comparison between the results of differential expression of these two target genes via RNA-Seq (FPKM) and RT-qPCR showed some divergence signaling the importance of using appropriate reference genes to validate the RNA-Seq results. Additionally, 13 target genes including two transcripts of unknown function were evaluated via RT-qPCR, as well as the developmental timecourse relative expression of FLOWERING LOCUS T (FT) gene over six time points in mature leaf. The selection and validation of reference genes were essential for the correct interpretation of RT-qPCR data and can be used as a guide in sugarcane flowering studies, especially those of photoperiodic flowering induction.