Peptídeos vegetais bioativos da biodiversidade brasileira e atividade citotóxica

Abstract

Peptídeos cíclicos têm atraído considerável atenção nos últimos anos devido às suas propriedades estruturais únicas e ao seu potencial de aplicação como fármacos, biomateriais e biossensores. Entre as classes encontradas em plantas, destacam-se os orbitídeos e os ciclotídeos, considerados exclusivos desse reino. Os orbitídeos são substâncias de baixo peso molecular, constituídos por 5 a 16 resíduos de aminoácidos, ciclizados via cabeça-cauda (N–C) e desprovidos de ligações de dissulfeto. Os ciclotídeos são peptídeos cíclicos constituídos por aproximadamente 27 a 38 resíduos de aminoácidos e apresentam três ligações dissulfeto, que conferem um arranjo estrutural altamente estável, conhecido como nó de cistina cíclico (Cyclic Cystine Knot – CCK). Neste trabalho, as espécies Croton heliotropiifolius e Croton campanulatus (Euphorbiaceae) foram investigadas como fontes de orbitídeos, enquanto Viola cerasifolia (Violaceae) foi estudada quanto à presença de ciclotídeos. O látex de C. heliotropiifolius foi submetido a processos de extração, pré-purificação e isolamento, resultando na obtenção de dois novos orbitídeos, os quais foram caracterizados por RMN, UPLC-MS/MS e análise de aminoácidos, sendo denominados [1–10-NαC]-croheorb A1 e A2. A fração enriquecida nesses orbitídeos apresentou efeito citotóxico frente às linhagens tumorais HCT116, MDA-MB-231 e MCF7 na concentração de 50 μg mL⁻¹, sem efeito sobre a linhagem não tumoral RPE1, sugerindo um perfil seletivo de ação. Todavia, não foi observada atividade no ensaio de erradicação de biofilme de Staphylococcus epidermidis. Os orbitídeos [1–7-NαC] crocaorbs A1 e A2, previamente obtidos de C. campanulatus, foram submetidos a estudos de dinâmica molecular, os quais permitiram a determinação de suas estruturas tridimensionais em DMSO e em água, sendo observada maior estabilidade conformacional em solvente biológico. A análise da configuração absoluta dos resíduos de aminoácidos, realizada por meio do reagente de Marfey, revelou a presença exclusiva de L-aminoácidos. Adicionalmente, o orbitídeo [1–7NαC]-crocaorb A1 foi sintetizado por síntese em fase sólida, resultando na obtenção do isômero trans, idêntico ao natural, e, de forma majoritária, o isômero cis. No estudo dos ciclotídeos, as partes aéreas de V. cerasifolia foram submetidas a processos de extração e purificação, e a espectrometria de massas indicou a presença de uma diversidade de ciclotídeos. No entanto, a elevada similaridade dos tempos de retenção dificultou o isolamento destes compostos com elevada pureza. O aprimoramento dos métodos cromatográficos permitiu a obtenção de uma fração constituída por uma mistura de cinco ciclotídeos, e o ciclotídeo de m/z 2.905,755 puro. Análises por MALDI, após redução e alquilação, confirmaram a natureza peptídica dessas substâncias, caracterizadas pela presença de três ligações de dissulfeto. A fração contendo a mistura dos cinco ciclotídeos apresentou efeito citotóxico frente às linhagens HCT116 e MCF7 na concentração de 50 μg mL⁻¹, entretanto, também foi observada elevada inibição do crescimento celular da linhagem não tumoral RPE1, indicando ausência de seletividade citotóxica nas condições avaliadas. De modo geral, os resultados obtidos ampliam o conhecimento sobre a diversidade química e o potencial biológico de peptídeos cíclicos provenientes de plantas brasileiras, consolidando espécies dos gêneros Croton e Viola como fontes promissoras de orbitídeos e ciclotídeos bioativos, além de estabelecer bases experimentais sólidas para estudos futuros de otimização sintética, isolamento em maior escala, elucidação estrutural detalhada e avaliação farmacológica dessas moléculas.

Cyclic peptides have attracted considerable attention in recent years due to their unique structural properties and potential applications as drugs, biomaterials, and biosensors. Among the classes found in plants, orbitides and cyclotides stand out and are considered exclusive to this kingdom. Orbitides are low-molecular-weight substances composed of 5 to 16 amino acid residues, cyclized through a head-to-tail (N–C) linkage and lacking disulfide bridges. Cyclotides are cyclic peptides composed of approximately 27 to 38 amino acid residues and contain three disulfide bonds, which confer a highly stable structural arrangement known as the cyclic cystine knot (CCK). In this study, the species Croton heliotropiifolius and Croton campanulatus (Euphorbiaceae) were investigated as sources of orbitides, while Viola cerasifolia (Violaceae) was studied for the presence of cyclotides. The latex of C. heliotropiifolius was subjected to extraction, pre-purification, and isolation processes, resulting in the identification of two new orbitides, which were characterized by NMR, UPLC-MS/MS, and amino acid analysis and named [1–10-NαC]-croheorb A1 and A2. The fraction enriched in these orbitides exhibited cytotoxic effects against the tumor cell lines HCT116, MDA-MB-231, and MCF7 at a concentration of 50 μg mL⁻¹, with no effect on the non-tumor cell line RPE1, suggesting a selective activity profile; however, no activity was observed in the biofilm eradication assay against Staphylococcus epidermidis. The orbitides [1–7-NαC]-crocaorbs A1 and A2, previously obtained from C. campanulatus, were subjected to molecular dynamics studies, which allowed the determination of their three-dimensional structures in DMSO and water, with greater conformational stability observed in a biological solvent. Analysis of the absolute configuration of the amino acid residues, performed using Marfey’s reagent, revealed the exclusive presence of L-amino acids. Additionally, the orbitide [1–7-NαC]-crocaorb A1 was synthesized by solid-phase peptide synthesis, resulting in the formation of the trans isomer, identical to the natural product, and predominantly the cis isomer. In the study of cyclotides, the aerial parts of V. cerasifolia were subjected to extraction and purification processes, and mass spectrometry indicated the presence of a diversity of cyclotides; however, the high similarity of retention times hindered the isolation of these compounds at a high level of purity. Optimization of the chromatographic methods allowed the isolation of fraction Fr.1, consisting of a mixture of five cyclotides, as well as a cyclotide with m/z 2,905.755, isolated with significant purity. MALDI analyses after reduction and alkylation confirmed the peptidic nature of these substances, characterized by the presence of three cysteine bridges. The fraction containing the mixture of five cyclotides exhibited cytotoxic effects against the HCT116 and MCF7 cell lines at a concentration of 50 μg mL⁻¹; however, a high inhibition of cell growth was also observed for the non-tumor cell line RPE1, indicating a lack of cytotoxic selectivity under the evaluated conditions. Overall, the results expand the knowledge of the chemical diversity and biological potential of cyclic peptides from Brazilian plants, consolidating species of the genera Croton and Viola as promising sources of bioactive orbitides and yclotides and establishing solid experimental bases for future studies on synthetic optimization, large-scale isolation, detailed structural elucidation, and pharmacological evaluation of these molecules.