Estudos estruturais com miotoxinas fosfolipase a2-like isoladas e recombinante da peçonha de bothrops pauloensis

Abstract

A toxicidade do veneno das serpentes do gênero Bothrops é resultante da ação integrada de várias toxinas, entre elas as fosfolipases A2 (PLA2s). Entre o grupo das PLA2s, há as PLA2s ativas enzimaticamente e as PLA2s desprovidas de atividade enzimática, denominadas proteínas PLA2-like. Apesar de sua inatividade enzimática, as proteínas PLA2-like desses venenos possuem potente ação miotóxica local; efeito o qual o soro antiofídico não é capaz de neutralizar efetivamente. Tendo em vista as limitações da soroterapia, é necessário compreender como essas miotoxinas agem localmente. Uma abordagem eficaz é o estudo estrutural-funcional destas toxinas com potenciais inibidores ou ativadores. Portanto, o presente trabalho tem como objetivo estudar a relação estrutura-função da BnSP-7 e sua isoforma BnSP-6, duas miotoxinas PLA2-like do veneno de Bothrops pauloensis, através de sua interação com ácidos graxos. Deste modo, essas proteínas foram obtidas a partir do veneno bruto de B. pauloensis por cromatografia líquida de troca iônica seguida por cromatografia em fase reversa. As frações obtidas foram analisadas por espectrometria de massa para a confirmação de ambas as identidades, no entando não foi possível identifica-las. Foi observado por técnica de espectroscopia de dicroísmo circular a preservação das estruturas secundárias dessas toxinas (enovelamento referente à PLA2). Foram obtidos cristais da amostra purificada após 21 dias de incubação a 283 K e por esses dados cristalográficos verificou-se que a amostra possuia a sequência da proteína BnSP-7. Além disso, no intuito de estudar as regiões de importância funcional destas toxinas foi procurada a obtenção da BnSP-7 por expressão heteróloga em sistema eucarioto (Pichia pastoris). Não foi possível induzir a levedura a produzir a proteína recombinante, porém há perspectivas quanto ao sucesso da expressão heteróloga. A expressão do modelo molecular da proteína BnSP-7 abrirá caminhos para atestar hipóteses prévias dos domínios estruturais que são responsáveis pela atividade dessas toxinas, assim como os mecanismos de inibição propostos.

The toxicity of Bothrops venom is the result of the integrated action of several toxins, including phospholipases A2 (PLA2s). Among the group of PLA2s, there are the enzymatically active PLA2s and the PLA2s devoid of enzymatic activity, called PLA2-like proteins. Despite their enzymatic inactivity, the PLA2-like proteins of these poisons have a potent local myotoxic action; an effect that the anti-oxyde serum is not able to neutralize effectively. Given the limitations of serotherapy, it is necessary to understand how these myotoxins act locally. An effective approach is the structural-functional study of these toxins with potential inhibitors or activators. Therefore, the present study aims to study the structure-function relationship of BnSP-7 and its BnSP-6 isoform, two PLA2-like myotoxins from Bothrops pauloensis venom, through their interaction with fatty acids. Thus, these proteins were obtained from the raw venom of B. pauloensis by ion exchange liquid chromatography followed by reverse phase chromatography. The fractions obtained were analyzed by mass spectrometry to confirm both identities, but it was not possible to identify them. The preservation of secondary structures of these toxins (entanglement related to PLA2) was observed by circular dichroism spectroscopy technique. Crystals were obtained from the purified sample after 21 days of incubation at 283 K and by these crystallographic data it was found that the sample had the BnSP-7 protein sequence. In addition, in order to study the regions of functional importance of these toxins, BnSP-7 was obtained by heterologous expression in a Eucharistic system (Pichia pastoris). It was not possible to induce yeast to produce recombinant protein, but there are prospects for the success of heterologous expression. The expression of the molecular model of the protein BnSP7 will open ways to attest previous hypotheses of the structural domains that are responsible for the activity of these toxins, as well as the proposed inhibition mechanisms.