Development of a 3D lung tissue model to study host-pathogen interactions in biofilms formed by Histoplasma capsulatum

Abstract

Dimorphic fungi, exemplified by the genus Histoplasma, exhibit a unique ability to undergo morphological transitions, existing as mycelia in soil and as yeast in the host. These facultative intracellular pathogens are known to initiate respiratory infections in mammals, which may progress to systemic infections. Additionally, their ability to form biofilms is a concern due to the inherent difficulty in controlling biofilm-associated infections. Although research efforts have predominantly focused on host-pathogen interactions using two-dimensional (2D) cellular models, the literature extensively describes a spectrum of three-dimensional (3D) models elucidating host-pathogen interactions across various microorganisms, including bacteria, viruses, and some rare fungi, such as Candida albicans and Aspergillus spp. However, research on dimorphic fungi remains limited. In this context, our study aimed to develop an in vitro lung tissue model to investigate the host-pathogen interaction of H. capsulatum biofilms. To achieve this, a 3D human lung tissue model was established through the co-culture of differentiated pulmonary epithelial cells (Calu-3), lung fibroblasts (MRC-5), and macrophage-like cells (THP-1) in an air-liquid interface (ALI) at a 3:3:1 ratio, using type I collagen hydrogels as a scaffold. Model viability was assessed using the XTT assay and total carbohydrate quantification over 28 to 30 days post-ALI differentiation. Model standardization was analyzed via transmission electron microscopy (TEM), multiphoton multiparametric microscopy (MMM), and RT-qPCR, while infection was assessed using MMM and RT-qPCR. Our findings regarding model development highlight the critical impact of collagen source selection and solubilization method. Among bovine, rat-tail, and human type I collagen sources, both rat-tail and human type I collagen demonstrated hydrogel formation capacity after 40 minutes of polymerization. Subsequent validation of our model, assessed through cellular viability (XTT assay) and total carbohydrate quantification, revealed increased metabolic activity and greater sugar consumption between days 7 and 14, as well as between days 9 and 19 of model development. Notably, this phenomenon coincided with the differentiation period of pulmonary epithelial cells in ALI conditions. Examining infection outcomes via TEM and MMM imaging revealed the hydrogel's ability to form pores that facilitate interaction with tissue cells and support cellular proliferation and migration over 21 days. Additionally, RT-qPCR data validating Calu-3 cell differentiation in ALI demonstrated increased expression of KRT5 and TP63 on day 11, MUC5AC on day 14, and SCGB1A1 on day 21. During the evaluation of H. capsulatum biofilm-host interactions, MMM results demonstrated the ability of the tissue model to be infected by both planktonic and biofilm-derived yeast cells using the EH-315 (bat-derived) and Hc1980 (human-derived) strains, with and without Hsp60 protein blockade using mAb 7B6. RT-qPCR results indicate that despite Hsp60 protein blockade, HSP60 and CBP1 gene expression increased in both planktonic and biofilm conditions compared to non-blocked conditions. In the host, increased expression of GNB2, PDCL, and ITGB2 was observed under infection conditions with Hsp60 blockade (both planktonic and biofilm forms), while increased expression of FERMT3 and NCKAP was only observed in biofilm infections without mAb 7B6. These findings suggest that the development of in vitro tissue models remains a challenge for standardization and routine laboratory application. Nonetheless, we successfully developed a 3D human lung tissue model with cellular viability up to 30 days, capable of promoting Calu-3 epithelial cell differentiation in an ALI and supporting infection by H. capsulatum yeast. Furthermore, host-pathogen interaction results highlight the importance of ITGB2 (CD18), which encodes the β subunit of Complement Receptor 3 (CR3), crucial for Histoplasma spp. recognition, with the involvement of FERMT3 in integrin pathway activation. Future studies on H. capsulatum biofilm-host interactions are necessary to validate these findings.

Fungos dimórficos, exemplificados pelo gênero Histoplasma, apresentam uma capacidade única de sofrer mudanças morfológicas, miceliar no solo e levedura no hospedeiro. Esses patógenos intracelulares facultativos são conhecidos por iniciar infecções respiratórias em mamíferos, que podem progredir para infecções sistêmicas. Além disso, sua capacidade de formar biofilmes é motivo de preocupação devido à dificuldade inerente em controlar infecções relacionadas a biofilmes. Embora os esforços de pesquisa tenham se concentrado predominantemente em interações hospedeiro-patógeno usando modelos celulares bidimensionais (2D), a literatura abrange extensivamente um espectro de modelos tridimensionais (3D) elucidando interações hospedeiro-patógeno em vários microrganismos, incluindo bactérias, vírus e alguns fungos raros, como Candida albicans e Aspergillus spp. No entanto, a pesquisa sobre fungos dimórficos continua limitada. Nesse contexto, nossa pesquisa teve como objetivo desenvolver um modelo de tecido pulmonar in vitro para o estudo da interação patógeno-hospedeiro de biofilmes de H. capsulatum. Para isso, o modelo de tecido pulmonar humano 3D foi desenvolvido através da co-cultura de células epiteliais pulmonares diferenciadas (Calu-3), células de fibroblastos pulmonares (MRC-5) e células semelhantes a macrófagos (THP-1) em uma interface ar-líquido (IAL) em uma proporção de 3:3:1, utilizando hidrogéis de colágeno tipo I como scaffold. A viabilidade do modelo foi avaliada usando o ensaio XTT e a quantificação de carboidratos totais durante 28 a 30 dias após a diferenciação por IAL. A padronização do modelo foi visualizada usando microscopia eletrônica de transmissão (TEM), microscopia multiparamétrica multiphoton (MMM) e RT-qPCR, e a infecção usando MMM e RT-qPCR. Nossos resultados quanto ao desenvolvimento do modelo demonstram o impacto crítico da seleção da fonte de colágeno e do método de solubilização. Entre as fontes de colágeno tipo I bovino, cauda de rato e humano, tanto a cauda de rato quanto o colágeno tipo I humano demonstraram capacidade de formar hidrogéis após 40 minutos de polimerização. Na validação subsequente de nosso modelo, avaliada através da viabilidade celular usando o método XTT e quantificação de carboidratos totais observou-se um aumento na atividade metabólica e maior consumo de açúcar entre o 7º e o 14º dia, bem como entre o 9º e o 19º dia do desenvolvimento do modelo. Significativamente, esse fenômeno coincidiu com o período de diferenciação ALI das células epiteliais pulmonares. Examinando os resultados da infecção através de imagens de TEM e MMM, foi revelada a capacidade do hidrogél de colágeno em formar poros que permitem a interação com as células do tecido e a capacidade de as células se multiplicarem e migrarem durante 21 dias. Além disso, dados de RT-qPCR para validação da diferenciação das células Calu-3 em IAL, demonstraram aumento na expressão dos genes KRT5 e TP63 no 11 º dia, MUC5AC no 14º dia e SCGB1A1 no 21º dia. Durante a avaliação da interação patógeno-hospedeiro de biofilmes de H. capsulatum, os resultados de MMM demonstraram a capacidade do tecido ser infectado por leveduras planctônicas e oriundas de biofilmes utilizando as cepas EH-315 (morcego) e Hc1980 (humana), com e sem o bloqueio da proteína Hsp60 utilizando mAb 7B6. Já os resultados de RT-qPCR apontam que apesar do bloqueio da proteína Hsp60, ocorreu o aumento da expressão dos genes HSP60 e CBP1 tanto na condição planctônica quanto de biofilmes quando comparados às condições sem bloqueio, e no hospedeiro observou-se aumento da expressão dos genes GNB2, PDCL e ITHB2 nas condições de infecção com bloqueio da proteína Hsp60, tanto planctônico quanto biofilme, e aumento na expressão dos genes FERMT3 e NCKAP somente na condição de biofilme sem o mAb 7B6. Dessa maneira, estes resultados sugerem que o desenvolvimento de tecidos in vitro continuam um desafio para padronização e aplicação rotineira em laboratórios. Além disso, foi possível desenvolver um tecido pulmonar humano 3D com viabilidade celular até 30 dias de análise, capaz de promover a diferenciação das células epiteliais pulmonares, Calu-3, em uma IAL e de ser infectado por leveduras de H. capsulatum. Além disso, os resultados da interação patógeno-hospedeiro sugerem a importância de ITGB2 (CD18), que codifica a subunidade β subunit do Receptor do Complemento 3 (CR3), importante para o reconhecimento de Histoplasma spp., com ajuda de FERMT3 na ativação da via das integrinas. Futuros estudos de interação patógeno-hospedeiro de biofilmes de H. capsulatum são necessários para comprovação destes resultados.

Los hongos dimórficos, ejemplificados por el género Histoplasma, poseen una capacidad única para experimentar transiciones morfológicas, presentándose como micelio en el suelo y como levadura en el huésped. Estos patógenos intracelulares facultativos son conocidos por iniciar infecciones respiratorias en mamíferos, las cuales pueden progresar a infecciones sistémicas. Además, su capacidad para formar biopelículas representa un desafío debido a la dificultad inherente en el control de infecciones asociadas a biopelículas. Aunque los estudios han centrado principalmente su atención en las interacciones huésped-patógeno mediante modelos celulares bidimensionales (2D), la literatura describe extensamente un espectro de modelos tridimensionales (3D) que han permitido elucidar interacciones huésped-patógeno en diversos microorganismos, incluyendo bacterias, virus y algunos hongos raros, como Candida albicans y Aspergillus spp. No obstante, la investigación sobre hongos dimórficos sigue siendo limitada. En este contexto, nuestro estudio tuvo como objetivo desarrollar un modelo de tejido pulmonar in vitro para investigar la interacción huésped-patógeno en biopelículas de H. capsulatum. Para ello, se estableció un modelo tridimensional de tejido pulmonar humano mediante la co-cultivo de células epiteliales pulmonares diferenciadas (Calu-3), fibroblastos pulmonares (MRC-5) y células similares a macrófagos (THP-1) en una interfaz aire-líquido (IAL) con una proporción de 3:3:1, utilizando hidrogeles de colágeno tipo I como andamiaje. La viabilidad del modelo se evaluó mediante el ensayo XTT y la cuantificación de carbohidratos totales durante 28 a 30 días tras la diferenciación en IAL. La estandarización del modelo se visualizó mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM), microscopía multiparamétrica multifotón (MMM) y RT-qPCR, mientras que la infección se analizó utilizando MMM y RT-qPCR. Nuestros resultados sobre el desarrollo del modelo evidenciaron el impacto crítico de la selección de la fuente de colágeno y el método de solubilización. Entre las fuentes de colágeno tipo I bovino, de cola de rata y humano, tanto el colágeno de cola de rata como el colágeno tipo I humano demostraron la capacidad de formar hidrogeles tras 40 minutos de polimerización. La validación posterior de nuestro modelo, evaluada mediante la viabilidad celular (ensayo XTT) y la cuantificación de carbohidratos totales, mostró un aumento en la actividad metabólica y un mayor consumo de azúcares entre los días 7 y 14, así como entre los días 9 y 19 del desarrollo del modelo. De manera significativa, este fenómeno coincidió con el periodo de diferenciación en IAL de las células epiteliales pulmonares. El análisis de la infección mediante imágenes de TEM y MMM reveló que el hidrogel de colágeno formó poros que facilitaron la interacción con las células del tejido y permitieron su proliferación y migración durante 21 días. Además, los datos de RT-qPCR utilizados para validar la diferenciación de las células Calu-3 en IAL mostraron un aumento en la expresión de los genes KRT5 y TP63 en el día 11, MUC5AC en el día 14 y SCGB1A1 en el día 21. Durante la evaluación de la interacción huésped-patógeno en biopelículas de H. capsulatum, los resultados de MMM demostraron la capacidad del tejido para ser infectado por levaduras tanto en fase planctónica como provenientes de biopelículas, utilizando las cepas EH-315 (de murciélago) y Hc1980 (humana), con y sin el bloqueo de la proteína Hsp60 mediante el anticuerpo monoclonal mAb 7B6. Los resultados de RT-qPCR indicaron que, a pesar del bloqueo de Hsp60, se produjo un aumento en la expresión de los genes HSP60 y CBP1 tanto en la condición planctónica como en biopelículas en comparación con las condiciones sin bloqueo. En el huésped, se observó un aumento en la expresión de los genes GNB2, PDCL e ITGB2 en condiciones de infección con bloqueo de Hsp60 (tanto en la fase planctónica como en biopelículas), mientras que los genes FERMT3 y NCKAP mostraron un incremento en su expresión únicamente en infecciones por biopelículas sin el mAb 7B6. Estos resultados sugieren que el desarrollo de modelos de tejidos in vitro sigue representando un desafío para su estandarización y aplicación rutinaria en laboratorios. No obstante, logramos desarrollar un modelo tridimensional de tejido pulmonar humano con viabilidad celular de hasta 30 días, capaz de promover la diferenciación de células epiteliales pulmonares Calu-3 en una IAL y de ser infectado por levaduras de H. capsulatum. Además, los resultados de la interacción huésped-patógeno resaltan la importancia de ITGB2 (CD18), que codifica la subunidad β del Receptor del Complemento 3 (CR3), clave para el reconocimiento de Histoplasma spp., con la participación de FERMT3 en la activación de la vía de integrinas. Se requieren futuros estudios sobre la interacción huésped-patógeno en biopelículas de H. capsulatum para confirmar estos hallazgos.