Análises moleculares e estratégias para a inibição do processo de reconhecimento e clivagem da Desmogleína 1 pela toxina esfoliativa A (ETA) de Staphylococcus aureus

Abstract

O Staphylococcus aureus é um microorganismo responsável pela a Síndrome da Pele Escaldada Estafilocócica (SPEE) em algumas espécies de animais, inclusive em humanos. É uma doença que promove lesões cutâneas graves, causada por toxinas esfoliativas (ETs) de S. aureus (ETA e ETB no caso de humanos), as quais são serino-proteases do tipo quimotripsina (SPTQs) que clivam a caderina desmogleína 1 (Dsg1). Resultados prévios sugerem a ativação da cavidade oxianiônica das ETs antes da clivagem da Dsg1, através de uma mudança conformacional do resíduo Pro192 após a interação das toxinas com o substrato. Por causa da alta especificidade das ETs, as mesmas não degradam diversos substratos peptídicos e não são suscetíveis a inibidores clássicos das SPTQs. Porém, as bases moleculares para esta alta especificidade permanecem incompreendidas, dada não só à falta de informações estruturais sobre a interação dessas enzimas com os ligantes do sítio ativo, mas também, e principalmente, com seu substrato natural, a Dsg1. Todavia, o isolamento de cepas de S. aureus codificadoras das ETs com resistência a antibióticos aumenta a importância da busca de inibidores para ETA a fim de tratar as lesões cutâneas decorrentes das infecções por essas cepas. O objetivo geral deste trabalho foi expressar e purificar a proteína ETA wt para a realização de ensaios de cristalização, inibição da atividade enzimática e cristalização com ligantes promissores. Foi realizada a prospecção de potenciais inibidores peptídicos e carbônicos, inicialmente determinados in silico e depois testados in vitro. Os inibidores carbônicos demonstraram uma inibição da ETA nos ensaios enzimáticos. Todavia, a técnica Phage Display também foi empregada na bioprospecção de sequências peptídicas com alta afinidade ao alvo ETA. Os resultados do sequenciamento genético aliado a ferramentas computacionais demonstraram que existem algumas sequências peptídicas relacionadas a proteínas humanas de superfície como a Protocaderina-15. Por fim, a realização da cristalização da proteína ETA wt foi bem sucedida, e, porém, os ensaios de cristalização da ETA com ligantes promissores ainda não apresentaram resultados satisfaorios. A determinação da estrutura cristalográfica da enzima associada a um inibidor pode proporcionar informações acerca do mecanismo de acomodação dos ligantes nos sítios ativos das toxinas ou nos sítios secundários moduladores.

Staphylococcus aureus is a human pathogen responsible for Staphylococcal Scalded Skin Syndrome (SSSS), a disease that causes severe skin lesions, driven by the exfoliative toxins (ETs) of S. aureus (ETA and ETB in the case of humans). These toxins are chymotrypsin-like serine proteases (CTSs) that cleave desmoglein1 (Dsg1). Previous results suggest the activation of the ETs' oxyanion hole before Dsg1 cleavage, via a conformational change of the Pro192 residue following toxin-substrate interaction. Due to the high specificity of the ETs, they don't degrade various peptide substrates and aren't susceptible to classic CTS inhibitors. However, the molecular bases for this high specificity remain poorly understood, not only due to the lack of structural information about these enzymes interacting with the active site ligands but also, and mainly, with their natural substrate, Dsg1. Still, the isolation of S. aureus strains encoding the ETs that are antibiotic-resistant heightens the importance of searching for ETA inhibitors to treat skin lesions resulting from these strain infections. The general objective of this study was to express and purify the wild-type ETA protein for crystallization assays, enzymatic activity inhibition, and co-crystallization with promising ligands. A prospecting of potential peptide and organic inhibitors was performed, initially determined in silico and later tested in vitro. The organic inhibitors showed ETA inhibition in enzymatic assays. However, the Phage Display technique was also used in the bioprospecting of peptide sequences with high affinity to the ETA target. Genetic sequencing results combined with computational tools showed that there are some peptide sequences related to human surface proteins like Protocadherin-15. Lastly, crystallization of the wild-type ETA protein was successful, and co-crystallization assays of ETA with promising ligands are underway. Determining the crystallographic structure of the enzyme associated with an inhibitor might provide insights into the mechanism of ligand accommodation in the active or modulatory secondary sites of the toxins.