Síntese, caracterização e purificação de bioconjugados peptídicos que apresentam atividade antitumoral

Abstract

Atualmente, o câncer é uma das principais causas de morte, principalmente nos países em desenvolvimento, representando hoje uma crise real para os sistemas de saúde em todo mundo. O tratamento convencional contra as células tumorais, como a quimioterapia e radioterapia, apresentam eficiência parcial, além de produzir uma gama de efeitos colaterais, diminuindo a qualidade de vida do paciente, além de estarem relacionados com a multirresistência por parte das células tumorais. Nesse contexto, estudos buscam o desenvolvimento de estratégias terapêuticas inovadoras para combater a doença. Pequenas moléculas, como peptídeos antitumorais, surgem como moléculas de interesse na terapia contra o câncer. Porém, a baixa especificidade e alta toxicidade sobre células normais, levam à busca por trabalhar com peptídeos antitumorais bioconjugados com peptídeos aptâmeros. Aptâmeros são moléculas relativamente pequenas que apresentam grande seletividade por apresentar interações com marcadores de membrana celular, como a glicoproteína de membrana CD44. Esses marcadores, geralmente são superexpressos em linhagens tumorais, e quando conjugados com peptídeos antitumorais, podem levar a maior eficácia na morte de células tumorais em decorrência a um direcionamento do peptídeo. Neste contexto, o objetivo desse trabalho é sintetizar os peptídeos LO1904, LO1908 e LO1908oxi, bem como avaliar os seus potenciais de ligação em alvos específicos em linhagens celulares, como adenocarcinoma de mama (MCF-7, ATCC HTB-22), adenocarcinoma de pulmão (A549, ATCC CCL-185) e células não tumorais de pulmão (MRC-5, ATCC CCL-171). Para tanto, foi realizada a síntese dos peptídeos em fase sólida e a purificação dos peptídeos LO1904, LO1908 e LO1908oxi por cromatografia líquida de alta eficiência. Além disso, culturas celulares foram submetidas à microscopia automática através do In Cell Analyzer, após incubação prévia com os peptídeos , apresentando marcações evidentes em diferentes concentrações. Em seguida, foi realizado o ensaio de viabilidade celular pela técnica de MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio) para as três linhagens testadas, bem como com a Melitina e Aureína. Com a seleção do aptâmeros LO1903, o qual apresentou marcações evidentes nas linhagens testas, foi realizada a síntese dos bioconjugados LO2121, LO2122 e LO2123. No ensaio de viabilidade celular foi possível concluir que todos os bioconjugados apresentam maior especificidade quando comparados com a Melitina. Colaborando com os resultados da viabilidade celular, no ensaio de degradação no soro foi possível constatar que os bioconjugados são estáveis em soro e não sofrem degradação por proteases em diferentes concentrações. Contudo, um fator interessante é que apesar da conjugação da Melitina com o aptâmeros, as moléculas não apresentaram modificações em sua estrutura, muito menos na sua atividade, como visto no ensaio de viabilidade.

Currently, cancer is one of the leading causes of death, especially in developing countries, representing today a real crisis for health systems worldwide. Conventional treatment against tumor cells, such as chemotherapy and radiotherapy, present partial efficiency, besides producing a range of side effects, reducing the quality of life of the patient, and are related to multidrug resistance by tumor cells. In this context, studies seek to develop innovative therapeutic strategies to combat the disease. Small molecules, such as antitumor peptides, emerge as molecules of interest in cancer therapy. However, the low specificity and high toxicity on normal cells lead to the search for working with antitumor peptides bioconjugated with aptamer peptides. Aptamers are relatively small molecules that show great selectivity by interacting with cell membrane markers, such as the membrane glycoprotein CD44. These markers are usually overexpressed in tumor cell lines, and when conjugated with antitumor peptides, they can lead to a higher efficacy in killing tumor cells due to the targeting of the peptide. In this context, the aim of this work is to synthesize the peptides LO1904, LO1908 and LO1908oxi, as well as to evaluate their binding potentials on specific targets in cell lines, such as breast adenocarcinoma (MCF-7, ATCC HTB-22), lung adenocarcinoma (A549, ATCC CCL-185) and non-tumor lung cells (MRC-5, ATCC CCL-171). To this end, solid-phase peptide synthesis and purification of LO1904, LO1908 and LO1908oxi peptides by high-performance liquid chromatography was performed. In addition, cell cultures were subjected to automated microscopy using In Cell Analyzer after prior incubation with the peptides , showing evident markings at different concentrations. Then, the cell viability assay was performed by the MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium) technique for the three tested strains, as well as with Melittin and Aurein. With the selection of the aptamer LO1903, which showed evident markings in the tested strains, the synthesis of the bioconjugates LO2121, LO2122 and LO2123 was performed. In the cell viability assay it was possible to conclude that all bioconjugates present higher specificity when compared to Melittin. Collaborating with the cell viability results, in the serum degradation assay it was possible to find that the bioconjugates are stable in serum and do not undergo degradation by proteases at different concentrations. However, an interesting factor is that despite the conjugation of Melittin with aptamers, the molecules did not present modifications in their structure, much less in their activity, as seen in the viability assay.