Dinâmica estrutural da proteína adaptadora Grb2, seu domínio SH2 e a interação com cumarina por ressonância magnética nuclear e fluorescência

Abstract

As células são submetidas a um constante e preciso controle de sobrevivência, crescimento, diferenciação e apoptose. Durante o processo de proliferação celular, estas também estão sujeitas a erros que podem gerar perda de controle de crescimento celular dando início ao crescimento descontrolado, que por sua vez, pode ocasionar o surgimento de tumores. Uma das vias que sofrem alterações é a via Mitogen Activated Protein Kinases (MAPK), que é mediada por proteínas como a adaptadora Growth factor receptor bound protein 2 (Grb2). A Grb2 é composta por três domínios, sendo dois SH3 (C e N-terminal) e um SH2. A Grb2, além de atuar como adaptadora, também regula a via da MAPK através de suas formas monomérica/dimérica. Com o objetivo de se entender a dinâmica estrutural de Grb2 e seu domínio Grb2-SH2, as ressonâncias do domínio foram assinaladas através de experimentos de tripla-ressonância e a estrutura calculada por CS-Rosetta através dos deslocamentos químicos da cadeia principal. A Grb2 foi assinalada por comparação com assinalamentos da SH2 e C-SH3. Os parâmetros de relaxação mostraram que essa proteína apresenta um equilíbrio monômero/dímero mais complexo do que o reportado pela literatura. Além disso, os parâmetros de relaxação do Grb2-SH2 mostraram a presença de um sítio superficial em dinâmica conformacional lenta em escala de tempo de μs a ms. Sítios em troca conformacional frequentemente estão envolvidos em reconhecimento molecular e alosteria. As perturbações nos deslocamentos químicos de Grb2-SH2 com a adição de cumarina no sistema vistos por RMN e a análise da supressão da intensidade por fluorescência, mostraram que a interação com o ligante compartilha o sítio II de reconhecimento de fosfopeptídeos em SH2, sugerindo que mudanças conformacionais podem estar ocorrendo no W60 para que cumarina tenha acesso ao sítio. Além do mais, a interação é entropicamente dirigida, ocorre em uma proporção 1:1 com constante de associação 𝐾��𝑏��~103 M-1.

The cells are subjected to a precise control of survival, growth, differentiation and apoptosis. During the process of cell proliferation it is also subject to errors which may lead to loss of cell growth control, initiating the growth above the necessity of the tissue which can cause tumors. One of the pathways that undergo changes is the Mitogen Activated Protein Kinases (MAPK), which is mediated by some proteins such as the Growth factor receptor bound protein 2 (Grb2). The Grb2 is composed of three domains, two SH3 (C and N-terminal) and one SH2. The Grb2, besides being an adapter, it also regulates the MAPK pathway through its monomeric/dimeric forms. In order to understand the structural dynamics of Grb2 and its Grb2-SH2 domain, the domain resonances were assigned by triple resonance experiments and the structure was calculated by CS-Rosetta through the chemical shifts of the backbone. The Grb2 was assigned by comparison with the SH2 and C-SH3 assignment, and the relaxation parameters obtained showed that this protein presents monomer/dimer equilibrium more complex than the reported in the literature. Moreover, the relaxation parameters of Grb2-SH2 showed a presence of a superficial site in slow conformational dynamics in a time scale of μs to ms. Sites in conformational exchange are often involved in molecular recognition and allostery. The perturbations in Grb2-SH2 chemical shifts with coumarin addition in the system verified through NMR and analysis of fluorescence quenching showed that the interaction with the ligand shares the site II of phosphopeptide recognition in SH2, suggesting that conformational exchange can occur in W60 in order to coumarin access the site. Besides, the interaction is entropically driven, with 1:1 proportion and association constant of 𝐾�𝑏�~103 M-1.