Expressão heteróloga da proteína GFP de Aequoria victoria em células de Escherichia coli e purificação por cromatografia de afinidade
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Data
Orientador
Ferro, Jesus Aparecido 
Coorientador
Facincani, Agda de Paula
Pós-graduação
Curso de graduação
Jaboticabal - FCAV - Ciências Biológicas
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Editor
Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Tipo
Trabalho de conclusão de curso
Direito de acesso
Acesso aberto
Resumo
Resumo (português)
As proteínas são amplamente utilizadas na ciência, se estendendo não somente a área da pesquisa, mas diversas outras, como saúde, produção de medicamentos ou mesmo na produção alimentícia. A expressão heteróloga de proteínas representa uma estratégia muito utilizada na biotecnologia para a produção de proteínas recombinantes, permitindo a síntese destas em organismos que não as expressam originalmente, incluindo bactérias, leveduras, microalgas, plantas e outros. Este trabalho teve como objetivo a clonagem, expressão e purificação da Proteína Fluorescente Verde (Green fluorescent protein - GFP), utilizando a bactéria Escherichia coli como hospedeiro. A sequência de nucleotídeos codificadora da proteína GFP foi clonada no vetor de expressão pET-SUMO e este vetor recombinante foi inserido em E. coli BL21(DE3) pLysS para indução da expressão. A proteína GFP, contendo uma cauda de histidina no seu N-terminal e a proteína SUMO (His-SUMO-GFP), foi purificada por cromatografia de afinidade com íons metálicos imobilizados (IMAC), utilizando coluna contendo níquel (Ni²+) imobilizado e acoplada a um cromatógrafo líquido de baixa pressão. A absorbância a 280 nm das frações eluídas da coluna foi registrada e o perfil proteico foi analisado por eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS (SDS-PAGE). A presença da proteína GFP nas frações também foi visualizada pela fluorescência emitida sob excitação de luz ultravioleta. A cauda de histidina com a proteína SUMO foi removida por digestão com a SUMO protease e a proteína GFP pura foi obtida por nova cromatografia de afinidade IMAC. O sistema de expressão pET-SUMO e E. coli BL21(DE3) pLysS e a purificação por IMAC demonstraram serem eficientes para a expressão e purificação da proteína GFP, resultando em uma proteína solúvel, estável e em quantidade suficiente para aplicações em estudos futuros.
Resumo (inglês)
Proteins play a central role in science and technology, extending beyond basic research to applications in health, pharmaceutical production, and the food industry. Heterologous expression has become a key biotechnological strategy for producing recombinant proteins, enabling their synthesis in organisms that do not naturally express them, such as bacteria, yeasts, microalgae, and plants. This work aimed to clone, express, and purify the Green Fluorescent Protein (GFP) using Escherichia coli as a host system. The GFP coding sequence was cloned into the pET-SUMO expression vector, and the recombinant construct was transformed into E. coli BL21(DE3) pLysS for induced expression. The His-SUMO-GFP fusion protein, containing an N-terminal His-SUMO tag, was purified by immobilized metal affinity chromatography (IMAC) using a nickel (Ni²⁺) column connected to a low-pressure liquid chromatography system. Protein elution was monitored by absorbance at 280 nm, and the purity was assessed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). GFP fluorescence was confirmed under ultraviolet excitation. The His-SUMO tag was removed by digestion with SUMO protease, and pure GFP was obtained through a second IMAC step. The pET-SUMO/E. coli BL21(DE3) pLysS system and IMAC purification proved highly efficient, yielding a soluble and stable GFP preparation suitable for future biochemical and biotechnological applications.
Descrição
Palavras-chave
Biotecnologia, Proteínas recombinantes, Purificação, DNA Recombinante
Idioma
Português
Citação
OLIVEIRA, J. A. M. de. Expressão heteróloga da proteína GFP de Aequorea victoria em células de Escherichia coli e purificação por cromatografia de afinidade. 2025. 59 f. Trabalho de conclusão de curso (Graduação em Ciências Biológicas) - Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho, Jaboticabal, 2025.
