Aplicação da metagenômica para estudos da diversidade viral em morcegos e análise da atividade inibitória de peptídeos contra os isolados virais

Abstract

A investigação da diversidade viral em animais é essencial para o monitoramento de zoonoses, sendo os morcegos importantes reservatórios de vírus zoonóticos, especialmente os de RNA. Com o avanço de tecnologias como a metagenômica, tem sido possível caracterizar o viroma de morcegos com maior profundidade. No entanto, no Brasil, esse tipo de estudo ainda é escasso e limitado a poucas regiões geográficas, o que dificulta o conhecimento sobre a diversidade viral associada às 181 espécies de morcegos que habitam o país. Diante dessa lacuna, o presente estudo teve como objetivo aplicar a metagenômica para investigar a variabilidade e mapear os vírus de RNA presentes em morcegos capturados na zona rural da microrregião de São José do Rio Preto (SP) e de Barreira (BA). Paralelamente à caracterização viral, o estudo também propôs utilizar os vírus detectados como alvos para a seleção de peptídeos com potencial antiviral, por meio da técnica de Phage Display. Foram coletados 75 morcegos pertencentes a cinco espécies distintas (Desmodus rotundus, n=30; Phyllostomus discolor, n=5; Molossus molossus, n=13; Molossus rufus, n=14; Artibeus lituratus, n=13), a partir dos quais foram extraídos os RNAs de macerados de fígado, intestino e pulmão. A construção de sete bibliotecas metagenômicas a partir desses pools de RNA possibilitou a classificação taxonômica de vírus, com a identificação de 1.200 contigs virais de diferentes espécies, incluindo vírus da diarreia viral bovina, Orf, Fowlpox, Yokapox e hepatite E (HEV). Dentre os vírus detectados, o HEV se destacou por sua predominância nas bibliotecas oriundas de D. rotundus e M. rufus, além de sua relevância clínico-epidemiológica ainda negligenciada em humanos. Com base nisso, os esforços foram direcionados à seleção de peptídeos específicos contra o HEV, com foco na RNA polimerase dependente de RNA (RdRp), uma enzima essencial para a replicação e disseminação viral. O gene da RdRp foi clonado no vetor pET28a(+) e utilizado para transformar a linhagem bacteriana Lemo21. A proteína recombinante foi expressa, purificada com sucesso e imobilizada em placas para os experimentos de Phage Display. Foram realizados quatro rounds de seleção com o objetivo de identificar peptídeos com alta afinidade pela RdRp do HEV. Os resultados de titulação dos fagos revelaram maior formação de unidades formadoras de placa (145 PFU) nos poços contendo a proteína-alvo, em comparação aos controles. A biblioteca de DNA dos fagos selecionados encontra-se em fase de sequenciamento por NGS. A partir desses dados, a identidade dos peptídeos será determinada, e análises de docking molecular permitirão avaliar suas interações com a RdRp. Complementando os experimentos laboratoriais, foi realizado um estudo in silico utilizando o software DNASTAR, com o objetivo de prever alvos peptídicos altamente antigênicos. Como resultado, cinco peptídeos se destacaram: VSDSVLVFELTD, EKGQDGSA, EKEILAL, GLECVIMEEC e VLDLTNS. Estas regiões da proteína serão exploradas quanto a interação por outros peptídeos expressos pelos fagos. Em suma, os resultados obtidos demonstram a eficácia da abordagem metagenômica na detecção da diversidade de vírus de RNA em morcegos brasileiros, além de evidenciar o potencial da técnica de Phage Display na seleção de peptídeos com afinidade para proteínas virais, como a RdRp do HEV, contribuindo tanto para a vigilância genômica quanto para o desenvolvimento de estratégias antivirais inovadoras.