Produção de etanol de segunda geração por Pichia membranifaciens na presença de inibidores isolados ou em associação

Abstract

O uso de biomassa vegetal para produção de etanol de segunda geração (2G) pode ser resposta a atual crise energética e demanda global de energia sustentável. Entretanto, um dos gargalos técnico para viabilizar esta produção é a hidrólise ácida da matéria-prima, os resíduos lignocelulósicos, pela possibilidade de produzir inibidores para os microrganismos fermentadores. A utilização de leveduras não convencionais, que apresentem tolerância a estes compostos tóxicos, pode ser uma alternativa promissora. Esta pesquisa objetivou determinar as doses máximas dos inibidores furfural, hidroximetilfirfural (HMF), ácido fênico, ácido levulínico e ácido fórmico, isolados e em associação, suportadas pela levedura Pichia membranifaciens(LJ04), assim como avaliar como estes compostos afetam a produção de biomassa e o rendimento de etanol. O estudo foi dividido em dois ensaios, ambos em meio sintético estéril composto por 45,0 g.L-1 de xilose e 25,0 g.L-1 de glicose, com suplementação de nutrientes e extrato de levedura. Foram avaliados parâmetros de cinética fermentativa (biomassa e velocidade de crescimento), concentrações de glicose, xilose, glicerol e etanol através de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Para o ensaio 1 o delineamento experimental foi o inteiramente casualizadoem esquema fatorial (5x4x4+1) e (5x4x3+1) com 3 repetições, sendo os fatores inibidores (furfural, hidroximetilfurfural, ácido fênico, ácido fórmico e ácido levulínico), doses (0,0; 3,0; 3,5 e 4,0 g.L-1), e tempos (0, 6, 12 e 24 horas). Para o ensaio 2, utilizou-se delineamento inteiramente casualizado com 8 tratamentos, 3 repetições, no qual as maiores doses de inibidores em associação suportadas pelas leveduras foram testadas. Os resultados obtidos indicam que: A cepa LJ04 da levedura Pichia membranifaciens tolerou concentrações dos inibidores furfural, HMF, ácidos fênico e levulínico, de forma isolada, ou em combinação nas doses de 3,0 a 3,5g.L-1; O ácido fórmico foi o inibidor que provocou maiores danos à fisiologia da levedura e produção de etanol, isolado ou em combinação, a partir de 3,0 g.L-1; O ácido fórmico influenciou negativamente a viabilidade celular, brotamentos e viabilidade de brotos, em todas as doses estudadas, levando a sobra de açúcares após 24 horas, que não foram metabolizados e baixos rendimentos do processo fermentativo e da produção de etanol; A LJ04 apresentou consumo de xilose, com tendência de maior transformação do açúcar na presença de ácido fênico e ácido levulínico; A produção e o rendimento de etanol foram maiores para os tratamentos com adição de ácido fênico.

A potential solution to the current energy problem and the need for sustainable energyworldwide is the production of second-generation (2G) ethanol from plant biomass.Acid hydrolysis is a major barrier for the 2G ethanol process because it generatesfermentation inhibitors that harm microbes. It's critical to look for microbes that canwithstand these substances. The LJ04 strain of the yeast Pichia membranes wasassessed in this study with the goals of determining resistance to high inhibitordosages, xylose intake, and adequate fermentation efficiency and biomass output. Thestudy was split into two assays, each conducted in a sterile synthetic mediumsupplemented with 45 g.L-1 of xylose and 25 g.L-1 of glucose and 45 g.L-1 of xylose,supplemented with yeast extract and nitrogen, phosphorus, potassium, magnesium,manganese, and zinc. High-performance liquid chromatography (HPLC) was used toassess the amounts of glucose, xylose, glycerol, ethanol, and fermentation kineticparameters (biomass and growth rate). In trial 1, the inhibitory factors (furfural,hydroxymethylfurfural, carbolic acid, formic acid, and levulinic acid), doses (0.0; 3.0;3.5 and 4.0 g.L-1), and times (0, 6, 12, and 24 hours) were all subjected to a completelyrandomized factorial scheme (5x4x4+1) and (5x4x3+1) with three replicates. Trial 2evaluated the greatest doses of inhibitors in combination supported by the yeasts usinga completely randomized design with eight treatments and three replicates. Accordingto the results, the LJ04 strain of the yeast Pichia membranifaciens was able towithstand concentrations of furfural, HMF, phenolic, and levulinic acids, either alone orin combination, at doses ranging from 3.0 to 3.5 g.L-1. The inhibitor that most severely damaged yeast physiology and ethanol production, either alone or in combination,starting at 3.0 g.L-1 was formic acid. At all doses examined, formic acid had adetrimental effect on cell, budding, and shoot viability, resulting in excess sugars thatwere not metabolized after 24 hours and low fermentation and ethanol productionyields; LJ04 showed xylose consumption, with a propensity for higher sugartransformation in the presence of phenolic acid and levulinic acid; Treatments thatadded carbolic acid produced and yielded more ethanol.