Estudo por dinâmica molecular e ressonância magnética nuclear de Viroporinas: análise da estrutura e do mecanismo de portão da proteína SH (HRSV) e da proteína M2 (vírus Influenza)
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Data
2018-01-29
Autores
Araujo, Gabriela Campos de
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Editor
Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Resumo
As proteínas SH do HRSV e M2 do IAV são membros das viroporinas, uma família de proteínas virais pequenas de membrana. A proteína SH tem 64 resíduos de aminoácidos e uma estrutura pentamérica composta por alfa-hélice transmembranar. A proteína M2 tem 97 resíduos e forma uma estrutura tetramérica tambem composta por alfa-hélice. A função mais importante destas proteínas é a condução de prótons que é facilitada por um poro aquoso que atravessa quase completamente a membrana. O conjunto de resíduos de W41 da M2 atua como um portão, restringindo o transporte de prótons para o interior viral. Estudos recentes de ressonância magnética nuclear de estado sólido (ssNMR) mostraram que as cadeias laterais do W41 têm uma amplitude de movimento muito limitadas. No entanto, detalhes do mecanismo de portão do W41 dependentes de pH ainda não foram esclarecidos. Nossos estudos recentes sobre a proteína SH do HhSV mostraram que o pentâmero tem duas conformações, uma aberta e outra fechada. No entanto, para a elucidação do mecanismo da proteína SH, HRSV e hospedeiro durante a infecção viral, mais detalhes de sua estrutura e função são necessários. Neste estudo, descrevemos e comparamos as características estruturais da proteína SH completa e do seu peptídeo transmembranar (TM) em diferentes estados de protonação das histidinas (H22 e H51) para fornecer informações detalhadas sobre o arranjo conformacional desses dois sistemas em diferentes ambientes (POPC, DMPC, domínios de raft e TFE / água) usando simulação de dinâmica molecular. Para a proteína M2, a fim de proporcionar uma reavaliação estrutural dos resíduos W41 e fornecer informações detalhadas sobre o rearranjo conformacional destes aminoácidos durante a condução de próton, os marcadores isotópicos de M2 foram realizados por expressão em Escherichia. coli; a proteína expressa foi purificada, reconstruída nas bicamadas DOPC:DOPE (4:1) e incorporada nos lipossomas. A análise do arranjo estrutural dos quatro resíduos W41 e a sua caracterização conformacional em pHs 5,8, 6,2 e 7,3 foram avaliadas usando ssNMR. Com os resultados obtidos, analisamos o comportamento da disposição dos resíduos de W41 durante a condução de prótons contribuindo para a compreensão deste mecanismo de portão W41. Resultados de interação proteína-bicamada mostram que o domínio TM é suficiente para interação e inserção da proteína SH, sugerindo um mecanismo livre de inserção. A análise do comprimento completo da SH e do peptídeo TM mostrou uma inclinação diferente em diferentes composições de bicamadas lipídicas, sugerindo interações entre os aminoácidos do N e C-terminal com a superfície da bicamada e influência da composição lipídica para o endereçamento dessa proteína na bicamada. A interação com a interface raft e não-raft, que também ocorre com a proteína M2, sugere um papel da SH na montagem e brotação viral. Diferentes composições lipídicas influenciam a estrutura do pentâmero da proteína SH e do peptídeo TM, assim como observado com a estrutura monomérica, mas a presença do poro aquoso não foi observado mesmo a protonações representando diferentes valores de pHs. Simulações na presença de desbalanço de carga mostraram uma propensão do peptídeo TM a formação do poro aquoso quando histidinas 22 estão protonadas e sob aplicação de uma potencial positivo. Com todos esses resultados, podemos mostrar a importância desta classe de proteínas na infecção viral e o estudo de sua estrutura encoraja a busca de novos alvos no combate a infecção viral por combinação de ferramentas experimentais e teóricas.
The SH protein from HRSV and M2 from IAV are member of the viroporin, a family of membrane small viral proteins. The structures of these proteins are essential to obtain an understanding of their molecular mechanism and to develop new class of anti-viral drugs, once its presence is crucial for viral pathogenicity. SH protein has 64 residues and its pentameric structure consists of transmembrane -helix. M2 protein has 97 residues and its tetrameric structure form an aqueous channel consists of transmembrane -helix. The most important function of these proteins is the conduction of protons which is facilitated by an aqueous pore that crosses almost completely the membrane. The Trp41 residues from M2 act as a gate, restricting the transport of protons into the viral interior. Recent studies of solid state nuclear magnetic resonance (ssNMR) have shown that the Trp41 side chains have very limited range of motion. However, details of the gate mechanism of Trp41 pH dependent have not yet been elucidated. Our recent studies on SH protein from HRSV showed that the pentamer has two stated of conformation, an opened and another closed. However, more details of its structure and function are necessary for mechanism elucidation of the SH protein, hRSV and host during viral infection. In this study, we describe and compare structural characteristics of full SH protein and its transmembrane (TM) peptide in different protonation states of histidines (H22 and H51) to provide detailed information on the conformational rearrangement of these systems in different environments (POPC, DMPC e raft bilayers and TFE/water) using molecular dynamics simulation. For M2 protein, in order to provide a structural reassessment of the M2 Trp41 residues and to provide detailed information on the conformational rearrangement of this amino acid during proton conduction, isotopic markers of M2 were performed by expression in E. coli; the expressed protein was purified, reconstructed on DOPC: DOPE (4:1) bilayers and incorporated into liposomes. Analysis of the structural arrangement of the four Trp41 residues and their conformational characterization at pHs 5.8, 6.2 and 7.3 were evaluated using ssNMR. With the obtained results, we analyzed the behavior of the arrangement of the residues of Trp41 during the conduction of protons, besides contributing to the understanding of this Tpr41 gate mechanism. Analysis of SH full length and TM peptide shown different tilt in different bilayers composition, suggest some specific interaction between N and C-terminal amino acids and the bilayer surface. The interaction with raft and no-raft suggest a role of SH in the viral assembly and budding. With all these results we could show the importance of this class of protein in the viral infection and the study of their structure encourage the researching of new target to virus infection by combination of experimental and theoretical tools.
The SH protein from HRSV and M2 from IAV are member of the viroporin, a family of membrane small viral proteins. The structures of these proteins are essential to obtain an understanding of their molecular mechanism and to develop new class of anti-viral drugs, once its presence is crucial for viral pathogenicity. SH protein has 64 residues and its pentameric structure consists of transmembrane -helix. M2 protein has 97 residues and its tetrameric structure form an aqueous channel consists of transmembrane -helix. The most important function of these proteins is the conduction of protons which is facilitated by an aqueous pore that crosses almost completely the membrane. The Trp41 residues from M2 act as a gate, restricting the transport of protons into the viral interior. Recent studies of solid state nuclear magnetic resonance (ssNMR) have shown that the Trp41 side chains have very limited range of motion. However, details of the gate mechanism of Trp41 pH dependent have not yet been elucidated. Our recent studies on SH protein from HRSV showed that the pentamer has two stated of conformation, an opened and another closed. However, more details of its structure and function are necessary for mechanism elucidation of the SH protein, hRSV and host during viral infection. In this study, we describe and compare structural characteristics of full SH protein and its transmembrane (TM) peptide in different protonation states of histidines (H22 and H51) to provide detailed information on the conformational rearrangement of these systems in different environments (POPC, DMPC e raft bilayers and TFE/water) using molecular dynamics simulation. For M2 protein, in order to provide a structural reassessment of the M2 Trp41 residues and to provide detailed information on the conformational rearrangement of this amino acid during proton conduction, isotopic markers of M2 were performed by expression in E. coli; the expressed protein was purified, reconstructed on DOPC: DOPE (4:1) bilayers and incorporated into liposomes. Analysis of the structural arrangement of the four Trp41 residues and their conformational characterization at pHs 5.8, 6.2 and 7.3 were evaluated using ssNMR. With the obtained results, we analyzed the behavior of the arrangement of the residues of Trp41 during the conduction of protons, besides contributing to the understanding of this Tpr41 gate mechanism. Analysis of SH full length and TM peptide shown different tilt in different bilayers composition, suggest some specific interaction between N and C-terminal amino acids and the bilayer surface. The interaction with raft and no-raft suggest a role of SH in the viral assembly and budding. With all these results we could show the importance of this class of protein in the viral infection and the study of their structure encourage the researching of new target to virus infection by combination of experimental and theoretical tools.
Descrição
Palavras-chave
RMN, SH protein, M2 protein, NMR, Viroporinas, Proteína SH, Proteína M2, Dinâmica molecular, Viroporin, Dynamics simulation