XAC4296: A multidomain and exclusive Xanthomonadaceae protein related to chromosome segregation, cell division, and bacterial fitness

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Data

2022-05-13

Autores

Oliveira, Amanda Carolina Paulino de [UNESP]

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Universidade Estadual Paulista (Unesp)

Resumo

Os micro-organismos apresentam um repertório limitado e extremamente adaptável de genes. Muitos destes genes codificam para proteínas contendo um único domínio ou multidomínios proteicos variáveis, sendo que em ambos os casos, esses domínios proteicos podem ser combinados de diferentes maneiras, e assim formar o repertório enzimático total de um genoma. A bactéria fitopatogênica Xanthomonas citri subsp. citri 306 (X. citri), agente etiológico do cancro cítrico tipo A (CC) e considerada uma das doenças mais devastadoras da citricultura, apresenta um repertório de proteínas multidomínios ainda pouco explorado. Neste sentido, estudos recentes demonstraram que as proteínas multidomínios pertencentes a superfamília das Transglicosilases Líticas (LTs), apresentam um papel importante para a biologia de X. citri. As LTs, estão relacionadas com o metabolismo do peptidoglicano, portanto, apresentando uma função importante relacionada com a síntese, remodelagem e degradação da parede celular bacteriana. Em particular, dentre as 14 LTs presentes no genoma de X. citri, uma é exclusiva para este gênero, e não caracterizada experimentalmente, denominada XAC4296 (XAC_RS21660). Neste trabalho, empregamos métodos in-silico, mutação sítio dirigida e caracterização funcional, com a finalidade avaliar o papel que XAC4296 pode desempenhar em X. citri. Nossos resultados indicam que a proteína XAC4296 apresenta uma estrutura multidomíno, formada por dois módulos estruturalmente distintos: o primeiro módulo transglicosilase (PG_binding1, SLT_2), e o segundo módulo epimerase (aldose-1-epimerase). Análises filogenéticas e de contexto genômico indicam que XAC4296 provavelmente foi originada por um evento de fusão gênica a partir do ancestral comum para Xanthomonas, Stenotrophomonas e Pseudoxanthomonas. Análises funcionais indicam que o gene XAC4296 é expresso durante a interação patógeno-hospedeiro, porém, não é essencial para X. citri ou desenvolvimento do CC, mas influi no ‘fitness’ bacteriano. Além disso, cepas de X. citri sem o gene XAC4296 apresentaram células filamentosas e em formato de correntes, com sua massa cromossômica dispersa, porém, ainda apresentando a formação de constrição de septo, desta forma, sugerindo, primeiro o erro de segregação cromossômica e, consequentemente, divisão celular, indicando que a função LT presente neste gene possa estar relacionada com este fenótipo observado. Em contrapartida, este fenótipo mutante foi completamente restaurado utilizando sacarose como fonte de carbono, e ácido glutâmico, como fonte de nitrogênio, sugerindo que o módulo epimerase da proteína XAC4296 possa contribuir para o metabolismo basal, impactando paralelamente, na divisão celular. Neste sentido foi possível elaborar a hipótese que, na ausência do gene XAC4296 e de precursores das vias metabólicas basais, a produção de piruvato é alterada, levando ao colapso dos mecanismos de segregação cromossômica e divisão celular. Além disso, o fenótipo mutante foi intensificado na presença do antibiótico ampicilina, atingindo 100% das células, sugerindo que como função adicional, a proteína XAC4296 contribui para a resistência a antibióticos β-lactâmicos em X. citri. A expressão da fusão mCherry-XAC4296 mostrou a proteína em ambiente citoplasmático, porém a presença de peptídeo sinal sugere uma localização secundária no periplasma, corroborando a hipótese de multifuncionalidade. Esses dados ressaltam o papel das proteínas multidomínio como mecanismo de geração de diversidade enzimática, aumentando sua funcionalidade sem ocasionar expansão genômica, trazendo novos conhecimentos sobre o papel que enzimas multidomínios podem desempenhar em X. citri.
Microorganisms have a limited and highly adaptable repertoire of genes capable of encoding proteins containing a single or variable multi-domains that can be combined in different ways to form the enzymatic repertoire. The phytopathogenic bacteria Xanthomonas citri subsp. citri (X. citri) (Xanthomonadaceae family), the etiological agent of Citrus Canker (CC), presents a collection of multi-domain and multi-functional enzymes (MFEs) that remains to be explored. For instance, recent studies have shown that multidomain proteins belonging to the superfamily of Lytic Transglycosylases (LTs) play an essential role in X. citri biology. The LT are enzymes that act on the metabolism of the peptidoglycan and bacterial cell wall. In particular, among the 14 LTs present in the genome of X. citri, one is exclusive to this genus and has not yet been experimentally characterized, called XAC4296 (XAC_RS21660), and apart from the Transglycosylase SLT_2 and Peptidoglycan binding-like domains, contains an unexpected epimerase domain linked to the central metabolism; therefore, resembling a canonical MFE. In this work, we experimentally characterized XAC4296 revealing its role as an MFE in X. citri, demonstrating their probable gene fusion origin before the closely-related Xanthomonadaceae members, Xanthomonas, Xyella, Stenotrophomonas, and Pseudoxanthomonas genera differentiation. Interestingly, it is likely that due to the extensive genome reduction, the Xyella genus have lost its XAC4296 homolog. In X. citri, the XAC4296 is expressed during plant-pathogen interaction, and the Δ4296 shows an impact on CC progression. Moreover, the Δ4296 exhibited chromosome segregation and cell division errors, and sensitivity to ampicillin, suggesting not only the LT activity but also that XAC4296 may also contribute to resistance to β-lactams. However, both Δ4296 phenotypes are partially or wholly restored when the mutant is supplemented with sucrose or glutamic acid as a carbon and nitrogen source, respectively, supporting the epimerase domain's functional relationship with the central carbon and cell wall metabolism. In this sense, it was possible to hypothesize that, when there is a “lack” of the XAC4296 gene and precursors of the basal metabolic pathways, the production of pyruvate is altered, leading to the collapse of the mechanisms of chromosomal segregation and cell division. Furthermore, The expression of the mCherry-XAC4296 fusion showed the 14 protein in a cytoplasmic environment, but the presence of a signal peptide suggests a secondary location in the periplasm, corroborating the hypothesis of multifunctionality. Taken together, these results elucidate the role of XAC4296 as an MFE in X. citri, also bringing new insights into the evolution of multidomain proteins and antimicrobial resistance in the Xanthomonadaceae family.

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Palavras-chave

Cancro cítrico, Proteínas multidomínios, Transglicosilase, Epimerase, Microorganismos, Biologia molecular, Microbiologia agrícola

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