Label-Free electrochemical capacitive biological sensors for molecular diagnostics

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Data

2022-10-21

Autores

Lucas Garrote, Beatriz

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Editor

Universidade Estadual Paulista (Unesp)

Resumo

The recent advances in biomedicine and technology have risen the popularization of molecular diagnosis which refers to the use of molecular techniques, such as polymerase chain reaction (PCR) or enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), to analyze biological markers (e.g., proteins, DNA or RNA). Both PCR and ELISA have been improved over the years with a broad range of applications. Nonetheless, both techniques have limitations that complicate their access in developing countries or their application in the field, since both need costly and high-size equipment with a stable source of power, costly reagents, and additional steps, which turn them into time-consuming assays, and high-qualified personnel to run the assays. REASSURED Point-of-care (POC or bedside testing) molecular diagnosis devices appear to overcome those limitations due to the facility to use handheld devices to medically examine a patient during a consultation where doctors and patients are no longer required to wait for lab results to make an appropriate diagnosis. Therefore, POC devices have the potential to become the primary care tool to diagnosis diseases in which the detection time is crucial to initiate the treatment, as is the case in non-communicable diseases (NCDs), and to avoid the spread of infection agents, as it is the case in infectious diseases, reducing the probability of outbreak and multiple deceases. POC molecular diagnosis devices are popularly known as biosensors which are constituted by three elements: receptor, transducer, and output system. Within those, transducer is the main element, since it is responsible to convert the biological/chemical signal of the analyte-receptor interaction into an electrical signal readable by the output system. The recognition of the analyte by the transducer can be directly (i.e., label-free) on only one-step without additional reagents (reagentless) by the variation of an inherent property of the transducer; or indirectly (i.e., label-based) by using additional steps for analyte labeling or additional labeled-molecules. This requirement increases the duration, the cost and the difficult of handling of the assay, so label-free and reagentless methodologies are more appropriate for POC devices. Those requirements are accomplished by using transducers based on electrochemical capacitance which also offers high-sensitivity and the possibility of miniaturization. Electrochemical capacitive transducers are composed by a redox-active nanostructure immobilized on the electrode surface with discrete energy levels. Those transducers use impedance-derived capacitance spectroscopy as electrochemical technique derived from EIS measurements that measures the electrochemical capacitance (C_μ) of those electroactive nanostructures. C_μ is an intrinsic characteristic of those electroactive nanostructures with thickness < 5nm, related to the energy storage and density-of-states (DOS) of the interface. C_μ biosensors are modelled by the quantum rate theory which resolves the quantum dynamics of the electron transfer (ET) in diffusionless electrochemical reactions, such as one of the electroactive interfaces, given by k=G/C_μ, where k is the electron transfer rate and G is the quantum conductance which measures the charge transport within the electrode and the electroactive interface. This theory demonstrated that in an ideal electron transfer situation, G=G_0, where G_0=g_s e^2/h ~ 77.5 μS is the quantum of conductance. Moreover, it demonstrated that C_μ is a consequence of the series combination of an electrostatic (C_e) and quantum (C_q) capacitances, such as 1/C_μ=(1/C_e)+(1/C_q), where C_e arises from the charge separation (l) due to the solvation of the electroactive switches and C_q emerges from the occupancy of the energy levels within the charge transfer with the electrode through the backbone of the electroactive molecule (L). In most of the quantum C_μ interfaces, l≪L, so C_e≫C_q, 1/C_e is close to zero and C_μ~C_q. According to those approximations, k=G_0/C_q, demonstrating that electroactive interfaces operate in a purely quantum regime, turning them in high-sensitive transducers for biosensing applications. The versatility and high-sensitivity of the C_q transducers convert them into promising tool for the development of analytical assays in a vast range of applications qualitative or quantitative. In this Ph.D. project we proposed the use of electrochemical capacitance transducers to develop novel biosensing assays for the diagnosis of relevant diseases: SARS-CoV-2 infection by the detection of spike protein (SP) and nucleocapsid protein (NP) in nasopharyngeal/oropharyngeal samples; Dengue virus infection by the quantification of NS1 protein in serum samples; and Alzheimer’s disease (AD) by the quantification of ptau-181 and ADAM10 proteins in human serum samples. SARS-CoV-2 is the novel circulating member of the family Coronaviridae that rapidly spread worldwide and became a global health threat. The development of biosensors became a priority until the development of the vaccines. In this doctoral thesis, the SARS-CoV-2 assay developed detected the presence of the viral proteins S and N in nasopharyngeal/oropharyngeal human samples with 77% of specificity and 80% of sensitivity, higher than the overall commercial rapid assays. Dengue virus also constituted a health threat in some tropical countries, such as Brazil. Efficient POC devices could provide rapid detection of the infection and monitorization of the progression of the disease to more severe haemorrhagic dengue. Thus, in this project we developed a miniaturized and high-sensitive Dengue virus assay for the quantification of the viral protein NS1. A novel amplifier signal methodology was coupled to the assay which increased up to 1000 times its sensitivity, enabling the detection of the virus since the biggening of the infection. Moreover, in this doctoral thesis, C_q transducers were applied to the first-time label-free quantification of two AD serum biomarkers, ADAM10 and ptau-181. Two ADAM10 assay were developed by using two antibodies that recognized a distinct ADAM10 isoforms. The analytical features of each assay were resolved by measurements on the C_q transducer which enable the determination of the association constant (K_a), limit-of-detection (LOD), limit-of-quantification (LOQ). Both assays demonstrated similar K_a and LODs and LOQs in the nanogram per millilitre range. Also, the specificity of each assay was analysed by the quantification of the protein in serum samples from AD patients and healthy individuals. In the case of the ptau-181 assay, the concentration range in human serum samples was picogram per milliltre, so three different C_q transducers based on a redox peptide self-assembled monolayer (SAM), the redox peptide SAM coupled to the amplifier signal methodology and a CdTe quantum dot ensemble, were analysed in terms of LOD and LOQ to evaluate which of them would be suitable for the application. The sensitiveness of the rPep SAM was not enough to quantify the protein in such concentration range, while the alternative with the amplifier signal and the QD-based transducers were suitable for the application. In summary, in this doctoral thesis it was demonstrated the potential of the electrochemical capacitance technique for the development of transducers for POC devices. The versatility of the technique enables a vast range of applications which diverse analytical features requirement. Accordingly, the objectives proposed in the beginning of this project were successfully achieved and new prospect for future research have been created.
Os recentes avanços da biomedicina e da tecnologia fizeram com que a popularização do diagnóstico molecular se refere ao uso de técnicas moleculares, como a reação em cadeia da polimerase (PCR) ou o ensaio imunoenzimático (ELISA), para analisar marcadores biológicos (por exemplo, proteínas, ADN ou ARN). Tanto o PCR quanto o ELISA foram aprimorados ao longo dos anos com uma ampla gama de aplicações. No entanto, ambas as técnicas apresentam limitações que dificultam seu acesso em países em desenvolvimento ou sua aplicação em campo, pois ambas necessitam de equipamentos caros e de grande porte com fonte de energia estável, reagentes caros e etapas adicionais, que as tornam demoradas ensaios e pessoal altamente qualificado para executar os ensaios. Os dispositivos de diagnóstico molecular no ponto de atendimento (POC ou teste à beira do leito) parecem superar essas limitações devido à facilidade de usar dispositivos portáteis para examinar clinicamente um paciente durante uma consulta em que médicos e pacientes não precisam mais aguardar os resultados do laboratório para fazer um diagnóstico adequado. Portanto, os dispositivos POC têm potencial para se tornar a ferramenta de atenção primária para o diagnóstico de doenças em que o tempo de detecção é fundamental para iniciar o tratamento, como é o caso das doenças não transmissíveis (DCNT), e para evitar a disseminação de agentes infecciosos, como é o caso das doenças infecciosas, reduzindo a probabilidade de surtos e múltiplos óbitos. Os dispositivos de diagnóstico molecular POC são popularmente conhecidos como biossensores que são constituídos por três elementos: receptor, transdutor e sistema de saída. Dentre eles, o transdutor é o elemento principal, pois é responsável por converter o sinal biológico/químico da interação analito-receptor em um sinal elétrico legível pelo sistema de saída. O reconhecimento do analito pelo transdutor pode ser diretamente (ou seja, sem rótulo) em apenas uma etapa sem reagentes adicionais (sem reagente) pela variação de uma propriedade inerente do transdutor; ou indiretamente (isto é, baseado em rótulo) usando etapas adicionais para rotulagem de analito ou moléculas rotuladas adicionais. Essa exigência aumenta a duração, o custo e a dificuldade de manuseio do ensaio, de modo que as metodologias sem rótulo e sem reagente são mais apropriadas para dispositivos POC. Esses requisitos são atendidos por meio de transdutores baseados em capacitância eletroquímica que também oferece alta sensibilidade e possibilidade de miniaturização. Os transdutores eletroquímicos capacitivos são compostos por uma nanoestrutura redox-ativa imobilizada na superfície do eletrodo com níveis de energia discretos. Esses transdutores usam espectroscopia de capacitância derivada de impedância como técnica eletroquímica derivada de medidas de EIS que mede a capacitância eletroquímica (C_μ) dessas nanoestruturas eletroativas. C_μ é uma característica intrínseca dessas nanoestruturas eletroativas com espessura < 5nm, relacionada ao armazenamento de energia e densidade de estados (DOS) da interface. Os biossensores C_μ são modelados pela teoria da taxa quântica que resolve a dinâmica quântica da transferência de elétrons (ET) em reações eletroquímicas sem difusão, como uma das interfaces eletroativas, dada por k=G/C_μ, onde k é a taxa de transferência de elétrons e G é a condutância quântica que mede o transporte de carga dentro do eletrodo e da interface eletroativa. Esta teoria demonstrou que em uma situação ideal de transferência de elétrons, G=G_0, onde G_0=g_s e^2/h ~ 77,5 μS é o quantum de condutância. Além disso, demonstrou que C_μ é uma consequência da combinação em série de uma capacitância eletrostática (C_e) e quântica (C_q), como 1/C_μ=(1/C_e)+(1/C_q), onde C_e surge da carga separação (l) devido à solvatação dos comutadores eletroativos e C_q emerge da ocupação dos níveis de energia dentro da transferência de carga com o eletrodo através da espinha dorsal da molécula eletroativa (L). Na maioria das interfaces quânticas C_μ, l≪L, então C_e≫C_q, 1/C_e é próximo de zero e C_μ~C_q. De acordo com essas aproximações, k=G_0/C_q, demonstrando que interfaces eletroativas operam em regime puramente quântico, tornando-as transdutores de alta sensibilidade para aplicações de biossensores. A versatilidade e alta sensibilidade dos transdutores C_q os convertem em uma ferramenta promissora para o desenvolvimento de ensaios analíticos em uma vasta gama de aplicações qualitativas ou quantitativas. Neste doutorado projeto propusemos o uso de transdutores eletroquímicos de capacitância para desenvolver novos ensaios de biossensor para o diagnóstico de doenças relevantes: infecção por SARS-CoV-2 pela detecção de proteína spike (SP) e proteína nucleocapsídica (NP) em amostras nasofaríngeas/orofaríngeas; Infecção pelo vírus da dengue pela quantificação da proteína NS1 em amostras de soro; e doença de Alzheimer (DA) pela quantificação das proteínas ptau-181 e ADAM10 em amostras de soro humano. O SARS-CoV-2 é o novo membro circulante da família Coronaviridae que se espalhou rapidamente pelo mundo e se tornou uma ameaça à saúde global. O desenvolvimento de biossensores tornou-se prioridade até o desenvolvimento das vacinas. Nesta tese de doutorado, o ensaio SARS-CoV-2 desenvolvido detectou a presença das proteínas virais S e N em amostras humanas nasofaríngeas/orofaríngeas com 77% de especificidade e 80% de sensibilidade, superior aos ensaios rápidos comerciais gerais. O vírus da dengue também constituiu uma ameaça à saúde em alguns países tropicais, como o Brasil. Dispositivos POC eficientes podem fornecer detecção rápida da infecção e monitoramento da progressão da doença para dengue hemorrágica mais grave. Assim, neste projeto desenvolvemos um ensaio de vírus Dengue miniaturizado e de alta sensibilidade para a quantificação da proteína viral NS1. Uma nova metodologia de sinal amplificador foi acoplada ao ensaio que aumentou em até 1000 vezes sua sensibilidade, possibilitando a detecção do vírus desde o início da infecção. Além disso, nesta tese de doutorado, os transdutores C_q foram aplicados na primeira quantificação sem marcação de dois biomarcadores séricos de DA, ADAM10 e ptau-181. Dois ensaios de ADAM10 foram desenvolvidos usando dois anticorpos que reconheceram isoformas distintas de ADAM10. As características analíticas de cada ensaio foram resolvidas por medições no transdutor C_q que permitem a determinação da constante de associação (K_a), limite de detecção (LOD), limite de quantificação (LOQ). Ambos os ensaios demonstraram K_a e LODs e LOQs semelhantes na faixa de nanogramas por mililitro. Além disso, a especificidade de cada ensaio foi analisada pela quantificação da proteína em amostras de soro de pacientes com DA e indivíduos saudáveis. No caso do ensaio ptau-181, a faixa de concentração em amostras de soro humano foi de picograma por mililitro, então três transdutores C_q diferentes baseados em uma monocamada automontada de peptídeo redox (SAM), o peptídeo redox SAM acoplado à metodologia de sinal amplificador e um ensemble de pontos quânticos de CdTe, foram analisados ​​em termos de LOD e LOQ para avaliar qual deles seria adequado para a aplicação. A sensibilidade do rPep SAM não foi suficiente para quantificar a proteína em tal faixa de concentração, enquanto a alternativa com o sinal amplificador e os transdutores baseados em QD foram adequados para a aplicação. Em resumo, nesta tese de doutorado foi demonstrado o potencial da técnica de capacitância eletroquímica para o desenvolvimento de transdutores para dispositivos POC. A versatilidade da técnica possibilita uma vasta gama de aplicações que exigem diversas características analíticas. Assim, os objetivos propostos no início deste projeto foram alcançados com sucesso e novas perspectivas para pesquisas futuras foram criadas.

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Palavras-chave

Biosensor, Electrochemical analysis, Impedance spectroscopy, Molecular diagnostics, Transducers, Biossensores, Analise eletroquímica, Diagnóstico aspectos moleculares, Transdutores, Espectroscopia de impedancia

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