Efeito da vitamina D sobre diferenciação de linfócitos T reguladores induzida por interação entre receptor TNFR2 e TNF de membrana presente em monócitos M2 de gestantes portadoras de pré-eclâmpsia

Introdução: A pré-eclâmpsia (PE) é uma síndrome específica da gravidez caracterizada por ativação de monócitos com perfil inflamatório (M1) em detrimento do perfil anti-inflamatório M2, resultando em níveis elevados de citocinas pró-inflamatórias, como o fator de necrose tumoral (TNF-α). O TNF-α é produzido como uma proteína de transmembrana (mTNF-α) que pode ser proteoliticamente clivada pela enzima conversora de TNF (TACE) dando origem ao TNF solúvel (TNF-α). A ligação de TNF-α com os receptores TNFR1 e TNFR2 na superfície celular ativa diferentes vias de sinalização. TNFR1 pode ser ativado por ligação com ambos mTNF-α e TNF-α, enquanto TNFR2 é principalmente ativado por mTNF-α. O TNFR2 é predominantemente expresso por células T reguladoras CD4+/FoxP3+ e, a co-expressão de CD25 com TNFR2 identifica células com maior capacidade supressora. Em vista disso, o uso de moduladores da resposta inflamatória como a vitamina D, no tratamento de células de gestantes com PE pode ser importante para melhorar a resposta inflamatória através da ativação de células com perfil M2 e Treg, capazes de modular e suprimir a inflamação presente nessa síndrome da gestação. Objetivo: O presente projeto tem como objetivo avaliar se o tratamento com vitamina D aumenta a expressão de monócitos M2 em gestantes portadoras de PE e, consequentemente, induz aumento de linfócitos Treg por essas gestantes. Sujeitos e Métodos: O sangue periférico de 10 gestantes portadoras de PE e 10 mulheres saudáveis, não-grávidas (NP) foi obtido e as células mononucleares (PBMCs) foram cultivadas na presença ou ausência de vitamina D por 24h, sendo a expressão por monócitos dos receptores CD14, CD163, CD206, TNFR2 e de mTNF-α e a expressão de linfócitos T reguladores CD4, CD25, TNFR2 e FoxP3 determinada por citometria de fluxo. Os resultados foram analisados por testes não paramétricos com nível de significância de 5%. Resultados: Monócitos e linfócitos cultivados juntos na presença ou ausência de VD apresentaram diferença significativa em relação a mulheres NP para os parâmetros, mTNF-α, CD163, FoxP3 e FoxP3+TNFR2. Além disso, o tratamento com VD aumentou a percentagem de linfócitos expressando FoxP3 e FoxP3+TNFR2. Conclusão: Os resultados preliminares indicam que a VD tem potencial de melhorar a resposta inflamatória em gestantes pré-eclâmpticas através do aumento da expressão de células com perfil anti-inflamatório, sendo elas, tanto monócitos M2 como linfócitos Treg. Sendo assim, o uso da vitamina D, poderá induzir a modulação da resposta inflamatória observada na PE, e possivelmente, poderá, futuramente, ser associada ao tratamento dessa importante síndrome da gestação.

Resumo (inglês)

Introduction: Preeclampsia (PE) is a pregnancy-specific syndrome characterized by the activation of monocytes with a pro-inflammatory (M1) phenotype at the expense of the anti-inflammatory M2 phenotype, resulting in elevated levels of pro-inflammatory cytokines such as tumor necrosis factor-alpha (TNF-α). TNF-α is initially produced as a membrane-bound protein (mTNF-α), which can be proteolytically cleaved by the TNF-α converting enzyme (TACE), generating its soluble form (sTNF-α). The binding of TNF-α to its receptors, TNFR1 and TNFR2, on the cell surface activates distinct signaling pathways. TNFR1 can be activated by both mTNF-α and sTNF-α, whereas TNFR2 is primarily activated by mTNF-α. TNFR2 is predominantly expressed by CD4⁺/FoxP3⁺ regulatory T cells (Tregs), and the co-expression of CD25 and TNFR2 identifies cells with enhanced suppressive capacity. In this context, the use of inflammatory response modulators, such as vitamin D, in the treatment of cells from pregnant women with PE may be important for improving the inflammatory profile by promoting the activation of M2-like monocytes and Treg cells, which are capable of modulating and suppressing the inflammation present in this gestational syndrome. Objective: This study aims to evaluate whether treatment with vitamin D increases the expression of M2 phenotype monocytes in pregnant women with PE and, consequently, induces an increase in Treg lymphocytes. Subjects and Methods: Peripheral blood was collected from 10 pregnant women with PE and 10 healthy non-pregnant (NP) women. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated and cultured in the presence or absence of vitamin D for 24 hours. Monocyte expression of CD14, CD163, CD206, TNFR2, and mTNF-α, as well as Treg lymphocyte expression of CD4, CD25, TNFR2, and FoxP3, were assessed by flow cytometry. Data were analyzed using non-parametric statistical tests, with a significance level set at 5%. Results: Monocytes and lymphocytes cultured together in the presence or absence of vitamin D showed significant differences compared to NP women for the following parameters: mTNF-α, CD163, FoxP3, and FoxP3⁺TNFR2. Moreover, vitamin D treatment increased the percentage of lymphocytes expressing FoxP3 and FoxP3⁺TNFR2. Conclusion: Preliminary results suggest that vitamin D has the potential to improve the inflammatory response in preeclamptic pregnant women by increasing the expression of cells with anti-inflammatory profiles, namely M2 monocytes and regulatory T cells. Therefore, vitamin D may contribute to the modulation of the inflammatory response observed in PE and, potentially, could be considered in future therapeutic strategies for this important pregnancy-related syndrome.

Palavras-chave

Vitamina D Monócitos M2 Citometria de fluxo Células T reguladoras Pré-eclâmpsia

Idioma

Português

Citação

VEIGA, Mariana Romão. Efeito da vitamina D sobre diferenciação de linfócitos T reguladores induzida por interação entre receptor TNFR2 e TNF de membrana presente em monócitos M2 de gestantes portadoras de pré-eclâmpsia. Supervisora: Maria Terezinha Serrão Peraçoli. 2025. Relatório (Pós-doutorado) - Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista (UNESP), Botucatu, 2025

URI

https://hdl.handle.net/11449/313183

Financiadores

Pró-Reitoria de Pesquisa (PROPe UNESP)

Coleções

Botucatu - IBB - Instituto de Biociências

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PublicaçãoTese de doutorado

Acesso aberto

Envolvimento do inflamassoma na imunidade inata e adaptativa em gestantes portadoras de pré-eclâmpsia

(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2017-02-23)

Veiga, Mariana Romão

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Peraçoli, Maria Terezinha Serrão

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Universidade Estadual Paulista (Unesp)

Introdução: A pré-eclampsia (PE) destaca-se como uma das principais causas de morbidade e mortalidade tanto materna como fetal, se caracteriza por ativação anormal do sistema imune inato e adaptativo. No plasma de gestantes portadoras de PE encontram-se níveis elevados de estruturas moleculares associadas ao estresse e morte celular, denominados padrões moleculares associados ao dano (DAMPs) como, proteína de choque térmico (Hsp70), HMGB1 (high mobility group box 1), Hialurona (HA) e Ácido Úrico, que parecem contribuir diretamente com a patogênese dessa doença. Essas DAMPs ligam-se a receptores presentes em células da imunidade inata, podendo ativar um complexo intracelular denominado inflamassoma, responsável pelo processamento e liberação de IL-1β e IL-18. Essas citocinas são potentes mediadores inflamatórios e importantes na ativação da resposta imune adaptativa, auxiliando a diferenciação de células T em Th17 e Th1, respectivamente. Na PE, a ocorrência de resposta inflamatória sistêmica parece decorrer da deficiência no controle de células T efetoras por células T reguladoras (Treg). Portanto, o balanço entre células Treg e Th17 pode ser crítico para a tolerância ao feto e para a prevenção da doença. Objetivos: O presente trabalho teve como objetivos: Avaliar o estado de ativação, endógena e induzida pelas DAMPs (urato monossódico (MSU), HA e Hsp70), em monócitos, pela identificação da presença do inflamassoma e associação com a produção de citocinas; Avaliar o envolvimento das subpopulações de células T (Th1, Th2, Treg e Th17) pela análise dos fatores de transcrição e pelo padrão de citocinas produzidas por essas células estimuladas com as DAMPs (MSU, HA e Hsp70). Métodos e Resultados: Foram estudadas 20 gestantes portadoras de PE, 20 gestantes normotensas (GN) e 20 mulheres saudáveis não grávidas (MNG). O plasma foi separado e armazenado à -80°C para dosagem das DAMPs (ácido úrico, HA, HMGB1 e Hsp70). Monócitos de sangue periférico foram incubados na presença ou ausência das DAMPs (MSU, HA e Hsp70). O sobrenadante obtido após 18h de cultivo foi aspirado e empregado para dosagem das citocinas TNF-α, IL-1β e IL-18 por ELISA. A presença de inflamassoma nessas células foi avaliada pela quantificação de RNAm de NLRP1, NLRP3, caspase-1, IL-1β, IL-18, TNF-α e HMGB1 por RT-qPCR após 4h de cultura. Os resultados mostraram concentração plasmática elevada de MSU, HA, Hsp70 e HMGB1 e expressão gênica endógena de NLRP1, NLRP3, caspase-1, IL-1β, TNF-α e HMGB1 significativamente maior em gestantes com PE em comparação aos grupos GN e MNG. Em relação à produção endógena de citocinas, IL-1β foi maior no grupo PE em relação aos grupos GN e MNG, enquanto IL-18 e TNF-α estão aumentadas apenas no grupo PE comparado ao grupo GN. O estímulo de monócitos de gestantes pré-eclâmpticas e de mulheres não grávidas com MSU induziu aumento na expressão gênica de NLRP3, caspase-1 e TNF-α em relação à expressão endógena nesses grupos, enquanto esse efeito não foi observado em gestantes normotensas. Quando os monócitos foram estimulados com HA observou-se aumento da expressão de RNAm de NLRP1, NLRP3, caspase-1, IL-1β, TNF-α e HMGB1, enquanto Hsp70 estimulou apenas a expressão de RNAm de TNF-α. A análise das citocinas por ELISA mostrou que monócitos de gestantes com PE produziram níveis endógenos e estimulados com MSU mais elevados de IL-1β, IL-18 e TNF-α em comparação ao grupo GN. Todos os grupos apresentaram aumento de IL-1β após estímulo com HA e aumento de IL-1β e TNF-α quando estimulados com Hsp70. Para estudo das subpopulações de células T as células mononucleares do sangue periférico foram avaliadas pela expressão endógena dos fatores de transcrição para células T-bet (Th1), GATA3 (Th2), RORc (Th17) e Foxp3 (Treg) por citometria de fluxo. Essas células foram cultivadas na ausência ou presença das DAMPs e o sobrenadante foi empregado para determinação das citocinas de perfil Th1 (IFN-γ e TNF-β), Th2 (IL-4), Treg (IL-10 e TGF-β1) e Th17 (IL-17 e IL-22) por ELISA. Os resultados mostraram polarização para perfis inflamatórios Th1/Th17 e diminuição de perfis anti-inflamatórios Th2/Treg em gestantes portadoras de PE associados a níveis endógenos elevados das citocinas inflamatórias TNF-α, IFN-γ, IL-17 e diminuídos de TGF-β e IL-10 quando comparadas com gestantes normotensas. O estímulo das células com MSU induziu aumento de IFN-γ, IL-22 em todos os grupos estudados, enquanto os estímulos com MSU e HA induziram aumento de IL-17 somente no grupo de normotensas. As DAMPs MSU e Hsp70 induziram aumento significativo da produção de TNF-α nos grupos de PE e MNG. Níveis elevados de TGF-β1 foram produzidos por células de gestantes portadoras de PE estimuladas com MSU, HA e Hsp70, enquanto HA e Hsp70 induziram diminuição da produção dessa citocina em gestantes normotensas. Conclusões: A maior expressão gênica endógena de NLRP1, NLRP3, caspase-1, IL-1β, HMGB1 e TNF-α em monócitos de gestantes pré-eclâmpticas confirma o estado de ativação dessas células na PE. Assim como a ativação endógena para perfil Th1/Th17 e expressão elevada de citocinas inflamatórias em gestantes pré-eclampticas demonstra o desbalanço inflamatório presente nessas gestantes. As DAMPs foram capazes de estimular tanto a resposta imune inata como a adaptativa em gestantes pré-eclâmpticas sugerindo que essas alarminas desempenham papel na ativação do sistema imune e na liberação de citocinas inflamatórias participando na patogênese dessa importante síndrome da gestação.

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