Avaliação do potencial produtivo de proteases por Bacillus subtilis em resíduos agroindustriais com perspectiva de aplicação em detergentes enzimáticos

As proteases microbianas representam um dos grupos de enzimas mais expressivos do mercado biotecnológico mundial, embora, o custo dos meios de cultivo permanece como um desafio econômico. O presente trabalho objetivou avaliar a produção enzimática de três linhagens de Bacillus subtilis utilizando meios complexos formulados com subprodutos agroindustriais (farelo de soja e leite). Os cultivos foram realizados em frascos Erlenmeyers (250 mL), sob agitação constante, seguindo um delineamento inteiramente casualizado (DIC) em arranjo fatorial 3x4 (cepas x meios), com cinco repetições independentes. Os meios tiveram o pH inicial ajustado para 7,0 e foram padronizados pela relação Carbono/Nitrogênio (C/N) equivalente ao meio padrão Luria-Bertani (LB) para garantir a equivalência nutricional inicial. A atividade proteolítica total foi quantificada pelo método da azocaseína (45 °C, pH 7,0), no qual uma unidade (U) foi definida como a variação de 0,01 na absorbância por minuto. Foram empregados brancos analíticos individuais para neutralizar interferências cromogênicas das matrizes de soja e leite desnatado UHT. Os resultados experimentais foram submetidos à ANOVA Omnibus seguida pelo teste de Bonferroni (α = 0,05). Os resultados experimentais permitiram visualizar que as maiores atividades volumétricas (U/mL) ocorreram no intervalo de 24 horas, período de máxima produtividade associado à fase logarítmica de crescimento seguido por um declínio em 48 horas possivelmente relacionado à exaustão de nutrientes e processos de autoproteólise. O meio misto (farelo de soja e leite desnatado) demonstrou um efeito sinérgico entre as fontes nitrogenadas, proporcionando um incremento significativo de 23% na atividade proteolítica em comparação ao meio de referência (LB). A interação detectada (p < 0,05) confirma que a modulação da síntese enzimática é cepa-dependente e altamente responsiva à indução por matrizes proteicas complexas. O rigor no controle do regime de velocidade inicial e a neutralização cromogênica rigorosa consolidam o potencial biotecnológico do aproveitamento desses subprodutos na otimização da produtividade enzimática, oferecendo uma alternativa técnica para a produção de proteases por Bacillussubtilis em sistemas de baixo custo, alinhados aos princípios da bioeconomia circular.

Resumo (inglês)

Microbial proteases represent one of the most significant enzyme groups in the global biotechnological market; however, the cost of culture media remains an economic challenge.This study aimed to evaluate the enzymatic production of three Bacillus subtilis strains usingcomplex media formulated with agroindustrial byproducts (soybean meal and milk). Cultivations were performed in Erlenmeyer flasks (250 mL) under constant agitation, following a completely randomized design (CRD) in a 3×4 factorial arrangement (strains × media), with five independent replicates. The initial pH of the media was adjusted to 7.0, and the carbon-to-nitrogen (C/N) ratio was standardized to match the Luria-Bertani (LB) reference broth, ensuring initial nutritional equivalence. Total proteolytic activity was quantified using the azocasein assay (45 °C, pH 7.0), wherein one unit (U) was defined as a 0.01 change in absorbance per minute. Individual analytical blanks were employed to neutralize chromogenic interferences from the soybean and UHT skim milk matrices. Data were subjected to an Omnibus ANOVA followed by Bonferroni's test (α = 0.05). Results indicated that the highest volumetric activities (U/mL) occurred at 24 hours, a peak productivity period associated with the logarithmic growth phase. This was followed by a decline at 48 hours, likely due to nutrient depletion and autoproteolysis. The mixed medium (soybean meal and skim milk) demonstrated a synergistic effect between the nitrogen sources, yielding a significant 23% increase in proteolytic activity compared to the LB medium. The detected interaction (p < 0.05) confirms that the modulation of enzymatic synthesis is strain-dependent and highly responsive to induction by complex protein matrices. Strict control of the initial velocity regime and rigorous chromogenic neutralization underscore the biotechnological potential of utilizing these byproducts to optimize enzymatic productivity. Ultimately, this approach offers a technically viable alternative for producing Bacillus subtilis proteases in low-cost systems, aligning with circular bioeconomy principles.

Resumo (espanhol)

Las proteasas microbianas representan uno de los grupos de enzimas más expresivos del mercado biotecnológico mundial, aunque el costo de los medios de cultivo sigue siendo un desafío económico. El presente trabajo tuvo como objetivo evaluar la producción enzimática de tres cepas de Bacillus subtilis utilizando medios complejos formulados con subproductos agroindustriales (harina de soja y leche). Los cultivos se realizaron en matraces Erlenmeyer (250 mL), bajo agitación constante, siguiendo un diseño completamente al azar (DCA) en arreglo factorial 3x4 (cepas x medios), con cinco repeticiones independientes. Los medios tuvieron el pH inicial ajustado a 7,0 y fueron estandarizados por la relación Carbono/Nitrógeno (C/N) equivalente al medio estándar Luria-Bertani (LB) para garantizar la equivalencia nutricional inicial. La actividad proteolítica total fue cuantificada por el método de la azocaseína (45 °C, pH 7,0), en el cual una unidad (U) se definió como la variación de 0,01 en la absorbancia por minuto. Se emplearon blancos analíticos individuales para neutralizar interferencias cromogénicas de las matrices de soja y leche desnatada UHT. Los resultados experimentales fueron sometidos a ANOVA Omnibus seguida por la prueba de Bonferroni (α = 0,05). Los resultados experimentales permitieron observar que las mayores actividades volumétricas (U/mL) ocurrieron en el intervalo de 24 horas, período de máxima productividad asociado a la fase logarítmica de crecimiento seguido por un declive a las 48 horas posiblemente relacionado con el agotamiento de nutrientes y procesos de autoproteólisis. El medio mixto (harina de soja y leche desnatada) demostró un efecto sinérgico entre las fuentes nitrogenadas, proporcionando un incremento significativo del 23% en la actividad proteolítica en comparación con el medio de referencia (LB). La interacción detectada (p < 0,05) confirma que la modulación de la síntesis enzimática es cepa-dependiente y altamente responsiva a la inducción por matrices proteicas complejas. El rigor en el control del régimen de velocidad inicial y la neutralización cromogénica rigurosa consolidan el potencial biotecnológico del aprovechamiento de estos subproductos en la optimización de la productividad enzimática, ofreciendo una alternativa técnica para la producción de proteasas por Bacillus subtilis en sistemas de bajo costo, alineados a los principios de la bioeconomía circular.

Palavras-chave

Bacillus subtilis Enzimas proteoliticas Azocaseína Farelo de soja Valoração de resíduos Proteolytic enzymes Azocasein Soybean meal Waste valorization Harina de soja Valorización de residuos

Idioma

Português

Citação

RONDINI, Robson Moraes. Avaliação do potencial produtivo de proteases por Bacillus subtilis em resíduos agroindustriais com perspectiva de aplicação em detergentes enzimáticos. 2026. 98 f. Dissertação (Mestrado em Engenharia de Biomateriais e Bioprocessos) – Universidade Estadual Paulista (Unesp), Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Araraquara, 2026.