Relative expression of insulin like growth factor I (IGFI) and follicle stimulating hormone receptor (FSHR) in follicles and ovarian tissue from Bos primigenius indicus (Nelore)

Abstract

O aperfeiçoamento das técnicas que objetivam a exploração do potencial reprodutivo das fêmeas requer a compreensão mais ampla dos mecanismos de controle de desenvolvimento folicular. Uma alternativa de estudo nesta esfera, é a quantificação da expressão relativa de genes envolvidos nos processos de recrutamento, seleção e desenvolvimento folicular, pelo emprego da técnica de transcrição - reversa associado a reação em cadeia pela polimerase (RT - PCR). O presente trabalho objetivou quantificar a expressão relativa dos genes insulin-like growth factor I (IGF-I) e do receptor do hormônio folículo estimulante (FSHR), tendo como controle interno o gene da gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH). Foram utilizados ovários bovinos de animais de matadouro em diferentes fases do ciclo estral. O RNA total dos folículos e tecido ovarianos foi purificado por TRIZOL. As reações de RT-PCR foram realizadas com o kit SuperScriptTM First-Strand. Os produtos de PCR foram analisados em gel de agarose e as bandas submetidas à análise densitométrica. Todos os genes foram amplificados observando-se a curva exponencial de amplificação, a validação do método foi realizada através de análise de regressão, sendo estabelecido o coeficiente de amplificação (E). A expressão relativa de mRNA para cada gene de interesse foi calculada pela fórmula estabelecida por Prelle et al.12. em todos os tecidos analisados, todos os genes foram expressos, sobressaltando-se diferenças nos diferentes ciclos estudados. Com relação os dados referentes ao coeficiente de amplificação (E), observou-se tanto para gene controle (GAPDH), como para o gene IGF-I concordância nos valores encontrados para as diferentes classes analisadas. Quanto ao gene IGF-I, a interpretação dos achados para a expressão relativa de mRNA pode está relacionada ao caráter constitutivo dessa proteína ou devido os transcritos não serem dependentes dos níveis de FSH. Observou-se diferenças na expressão relativa de mRNA de FSHR entre as classes de tecidos analisados, o que pode ser explicado pela variação do número de receptores nas células da granulosa nas diferentes fases do ciclo estral. Pode-se perceber a partir desse estudo que a técnica de RT-PCR semi quantitativo é de grande importância biotecnológica, possibilitando auxílio na compreensão da dinâmica folicular. Entretanto esses estudos devem ser ampliados com outros genes para melhor compreensão das etapas fisiológicas envolvidas na foliculogênese.

The improvement of techniques to maximize reproductive potential of females needs the whole comprehension of the controlling mechanisms of follicular development. An alternative for this purpose is the quantification of relative gene expression from those genes involved in recruitment, selection and follicular development, using reverse transcriptase - polymerase chain reaction (RT - PCR). The present study aimed to quantify relative gene expression from insulin-like growth factor I (IGF-I) and follicle stimulating hormone receptor (FSHR) in cattle (Bos primigenius indicus), using as internal control the gliceraldheyde 3 phosphate dehydrogenase (GAPDH) gene. Ovaries in different estral cycle stages were obtained from slaughtered animals. Total RNA from follicles and ovarian tissue was purified and the RT-PCR conditions were standardized. PCR products were analyzed in ethydium bromide agarose gels and the bands submitted to densitometric analysis. Exponential amplification curves were constructed and the method's validation was performed using regression analysis to determine the amplification coefficient (E) for each of the three genes. Relative expression for each gene was calculated using the formula described by Prelle et al.12. In every sample there was gene expression detected for each gene showing differences related to cycle temperature. Amplification coefficient (E) was similar between control gene (GAPDH) and IGFI, independently of the class analyzed. IGFI linear amplification could be related to the constitutive characteristic of this protein since the transcripts are not dependents of FSH levels. It was observed difference in FSHR mRNA expression between the classes analyzed. It could be due to the variation of the receptor number in granulosa cells for each different phase of estral cycle. Semi-quantitative RT-PCR has a large application in biotechnology since it is useful to help us the better understanding of follicular dynamics. However these studies must be conducted using other genes in order to provide new clues for the physiology of folliculogenesis.