Desenvolvimento e aplicação da técnica de Nested-RT-PCR para a detecção e identificação de variantes brasileiras do vírus da bronquite infecciosa

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Data

2017-08-02

Orientador

Montassier, Helio José

Coorientador

Pós-graduação

Microbiologia Agropecuária - FCAV

Curso de graduação

Título da Revista

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Editor

Universidade Estadual Paulista (Unesp)

Tipo

Dissertação de mestrado

Direito de acesso

Acesso abertoAcesso Aberto

Resumo

Resumo (português)

Em plantéis avícolas, é frequente a ocorrência de doenças infecciosas respiratórias e dentre estas, destaca-se a Bronquite Infecciosa (BI), uma doença aguda e altamente contagiosa de aves. A BI é causada pelo vírus da bronquite infecciosa (VBI), cujo processo infeccioso geralmente provoca perdas econômicas significativas para as criações avícolas. A extensa variação genética, especialmente nas regiões hipervariáveis (HVRs) do gene S1, é uma das principais características da evolução do VBI, e resulta no surgimento de diversas variantes, que requerem um diagnóstico molecular que inclua a detecção dessas novas estirpes, como o genótipo brasileiro (BR-VBI), pois a detecção e identificação do agente etiológico são essenciais para o controle dessa enfermidade. Para tanto, é necessário que os métodos de diagnóstico empregados sejam sensíveis, específicos e de baixo custo. Foi então desenvolvida e avaliada neste estudo uma técnica de Nested-RT-PCR (BR-Nested-RT-PCR) utilizando um conjunto de oligonucleotídeos iniciadores desenvolvido dentro da região HVR3 do gene S1 de estirpes variantes brasileiras do VBI para a detecção e identificação de linhagens do genótipo brasileiro do VBI presentes em amostras biológicas de aves e comparada com a Nested-RT-PCR universal, utilizando oligonucleotídeos iniciadores universais para a mesma região do gene S1. Os resultados demonstraram que a técnica BR-Nested-RT-PCR apresentou uma elevada sensibilidade na detecção de estirpes do genótipo BR-I do VBI e não gerou produtos amplificados a partir de amostras de vírus heterólogos testados (vírus da doença de Newcastle, metapneumovírus aviário, reovírus e vírus da doença de gumboro), nem de estirpes do VBI classificadas em outros genótipos.). Ademais, quando foram comparadas as técnicas BR-Nested-RT-PCR com a técnica universal de Nested-RT-PCR foram obtidas boa concordância (k = 0,67), sensibilidade relativa de 85,4% e especificidade relativa de 81,6% para a detecção direta e identificação de estirpes do genótipo BR em amostras de campo. Em conclusão, a técnica de BR-Nested-RT-PCR desenvolvida no presente estudo, oferece uma opção de menor custo e menor complexidade do que a técnica de RT-PCR em tempo real para detectar e diferenciar estirpes do genótipo BR-I do VBI, sem comprometer a especificidade ou a sensibilidade, tendo, assim, o potencial de viabilizar a adoção de meios mais efetivos para o diagnóstico direto de estirpes do genótipo BR-I do VBI em amostras colhidas de aves mantidas em criações comerciais.

Resumo (inglês)

Infectious bronchitis (IB) is an acute and highly contagious disease of birds. IB is caused by infectious bronchitis virus (IBV), which usually results in significant economic losses for poultry farms. The extensive genetic variation, especially in the hypervariable regions (HVRs) of the S1 gene, is one of the main characteristics of the evolution of IBV, and results in the appearance of several variants that require a molecular diagnosis which includes the detection of these new strains, such as Brazilian I genotype (BR-I), since the detection and identification of the causative agent are essential for the control of the disease. Therefore, the diagnostic methods used must be sensitive, specific and inexpensive. A Nested-RT-PCR (BR-Nested-RT-PCR) technique was developed and evaluated in this study using a set of primers designed for the HVR3 region of the S1 gene for the detection and identification of Brazilian genotype strains of IBV present in biological samples from birds and compared with universal Nested-RT-PCR using universal primers for the same region of the S1 gene. The results demonstrated that the BR-Nested-RT-PCR technique had a high sensitivity to detect IBV strains from BR-I genotype and did not generate amplified products from heterologous virus samples tested (Newcastle disease virus, avian metapneumovirus, Reovirus and Gumboro disease virus), neither from IBV strains of other genotypes. In addition, the comparison between BR-Nested-RT-PCR techniques with the universal Nested-RT-PCR technique revealed good agreement (k = 0.67), relative sensitivity of 85.4% and relative specificity of 81.6 % for the direct detection and identification of BR-I genotype strains in field samples. In conclusion, the BR-Nested-RT-PCR technique developed in the present study offers a lower cost and less complex option than the real-time RT-PCR technique to detect and differentiate strains of the BR-I genotype of IBV without compromising specificity or sensitivity, and has the potential to provide a more effective mean for the direct diagnosis of BR-I IBV strains in samples collected from birds reared in commercial flocks.

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Português

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