Maturação da afinidade de anticorpos de cadeia única contra o domínio de ligação ao receptor do SARS-CoV-2 e rastreamento por yeast surface display

Abstract

A COVID-19 resultou em impactos sem precedentes à saúde humana e à sociedade, sendo responsável por mais de 760 milhões de casos e 6,5 milhões de mortes em cerca de 3 anos e meio após o primeiro caso registrado. O Brasil foi muito afetado pela doença, já que mesmo possuindo apenas 2,7% da população mundial, foi responsável por mais de 10% dos casos que resultaram em morte dos pacientes. Isso ocorreu devido a alguns fatores agravantes como o atraso em estabelecer medidas de distanciamento social e na aquisição de vacinas. Apesar de mais de 5 milhões de pessoas já estarem com o esquema vacinal completo, ainda é imprescindível haver uma política de testagem para identificação e isolamento de infectados, não só devido ao surgimento constante de novas variantes, como também em virtude da Síndrome da COVID Longa. Tendo em vista essa necessidade de desenvolvimento de testes diagnósticos que sejam rápidos, baratos, acurados e sensíveis, o presente trabalho propôs a maturação da afinidade de fragmentos variáveis do anticorpo CC12.1, visando a obtenção de um candidato altamente específico ao vírus SARS-CoV-2. Para isso, foi feita mutagênese por saturação in silico desse anticorpo, determinando as trocas de resíduo mais promissoras para um aumento da interação antígeno-anticorpo de acordo com o seu valor de variação da energia livre (ΔΔG), as quais foram posteriormente testadas in vitro. Nesse processo, foram obtidas 11 mutações a serem testadas, sendo que 9 delas potencialmente apresentariam uma redução no ΔΔG, indicando uma melhora na estabilidade, e 2 foram usadas como contra- prova. Ao final dos experimentos, 10 das mutações propostas foram clonadas em E. coli DH5α, confirmadas por sequenciamento, transformadas em levedura S. cerevisiae EBY100 e após indução de expressão, foram avaliadas pela técnica yeast surface display (YSD) por citometria de fluxo. A partir dos resultados, os dois clones que apresentaram um maior aumento de afinidade (LeveP95A e PesadaS31N), comparado ao scFv selvagem, bem como um mutante de aumento intermediário (LeveS31Y), foram escolhidos para a realização de uma curva de afinidade. Desta forma, o mutante LeveS31Y apresentou KD 3 vezes menor que o KD da sequência selvagem, confirmando que a maturação in silico pode levar à obtenção de fragmentos variáveis de maior afinidade ao RBD de SARS-CoV-2. A partir desses resultados, a próxima etapa consiste em realizar uma curva de afinidade para todos os mutantes, bem como uma combinação de mutações.

COVID-19 was responsible for the unprecedented impact on human health and society, accounting for more than 760 million cases and 6.5 million deaths in about 3.5 years after the first recorded case. Brazil was severely affected by the disease, considering that despite having only 2.7% of the world's population, it was responsible for more than 10% of the global cases that resulted high patient deaths. This was due to some aggravating factors such as the delay in establishing social distancing measures and in acquiring vaccines. Even though more than 5 million people have already complete the vaccination schedule, it is still essential to have a testing policy for the identification and isolation of infected people, not only due to the constant emergence of new variants, but also due to the Long COVID Syndrome. Given this need to develop diagnostic tests that are fast, cheap and accurate, the present work proposed the affinity maturation of variable fragment of the CC12.1 antibody, aiming to obtain a highly virus-specific candidate. For this, mutagenesis by in silico saturation of the antibody was performed, determining the most promising residue exchanges for an increase in antigen-antibody interaction according to their variation of free energy value (ΔΔG), which were later tested in vitro. In this process, 11 mutations were obtained to be tested, 9 of which would potentially show a reduction in ΔΔG, indicating an improvement in stability, and 2 were tested as counterproof. At the end of the experiments, 10 of the proposed mutations were cloned in E. coli DH5α, confirmed by sequencing, transformed into yeast S. cerevisiae EBY100, and after expression induction they were evaluated by yeast surface display (YSD) technique by flow cytometry. From the results, the two clones that showed a greater increase in affinity (LeveP95A and PesadaS31N), compared to the wild-type scFv, as well as an intermediate increased mutant (LeveS31Y), were chosen for the realization of an affinity curve. In this experiment, the mutant LeveS31Y showed a KD 3 times lower compared to the same value of the wild sequence, confirming that the in silico maturation is a viable approach to obtain variable fragments with higher affinity to the SARS-CoV-2’s RBD. Therefore, the next step obtain an affinity curve for all the mutantes, as well as test a combination of mutations.