Isolamento microbiológico e caracterização molecular de micobactérias no leite de vacas positivas no teste de tuberculinização cervical comparativo

Abstract

A tuberculose, causada por Mycobacterium bovis, permanece como uma das principais doenças infecciosas de bovinos, em virtude dos prejuízos causados com a redução na produção de carne e leite, condenação de carcaças em abatedouros e embargos na comercialização de animais e produtos de origem animal, bem como pelo potencial zoonótico do patógeno, particularmente pela eliminação pelo leite. Ademais, micobactérias não tuberculosas ou atípicas são causa emergente de doenças em humanos e em animais. Apesar de a tuberculinização representar o principal teste diagnóstico “in vivo” da doença em rebanhos, poucos estudos têm avaliado a eliminação de micobactérias pelo leite em vacas positivas nos testes intradérmicos. O objetivo do presente estudo foi identificar espécies de Mycobacterium em amostras de leite de vacas positivas no teste de tuberculinização cervical comparativo. Um “pool” do leite dos quartos de 142 (2,97%) vacas positivas - proveniente de 4.766 animais tuberculinizados - foi coletado assepticamente e cultivado em condições de aerobiose a 37oC nos meios de Lowestein-Jensen e Stonebrink, mantidos por até 90 dias. Colônias compatíveis com micobactérias foram submetidas à coloração de Ziehl-Neelsen para o diagnóstico de bacilos álcool-ácido resistentes (BAAR) e detecção molecular. Catorze estirpes isoladas em 12 amostras (n=12/142, 8.4%) foram classificadas pela técnica de reação em cadeia da polimerase com enzimas de restrição (PCR-PRA) e sequenciamento como segue: M. mucogenicum tipo 2 (n=4), M. nonchromogenicum tipo 1 (n=3), M. hodleri type 1 (n=2), M. terrae tipo 3 (n=3), M. cookii tipo 1 (n=1), e M. szulgai tipo 1 (n=1). O sequenciamento do gene hsp65 revelou >98% de similaridade com as espécies de micobactérias depositadas no GeneBank, e detectou: M. engbaekii (n=5), M. arupense (n=4), M. nonchromogenicum (n=3) e M. heraklionense (n=2). Houve concordância na detecção das espécies de micobactérias entre PCR-PRA e sequenciamento em três dos isolados, exclusivamente da espécie M. nonchromogenicum (n=3/14; 21.4%). Árvore filogenética e dendograma (baseado no gene hsp65) dos 14 isolados revelou 4 clusters e 3 subclusters (79,0% de similaridade), respectivamente, e classificou os isolados como micobactérias atípicas agrupados no complexo M. terrae. Apesar da ausência de espécies do complexo M. tuberculosis nas amostras cultivadas, a presença de micobactérias atípicas, alerta para o risco de transmissão do patógeno pelo leite ou derivados para os humanos, visto que muitas dessas espécies de micobactérias já foram descritas causando infecções pulmonares e extrapulmonares em humanos imunocompetentes e imunossuprimidos

Tuberculosis caused by Mycobacterium bovis remains as one of the major infectious diseases of cattle, due to losses caused by the reduction in the meat and milk yield, condemnation of carcasses in slaughterhouses, and embargoes on the trade of bovine products, as well as the zoonotic potential of pathogen particularly by elimination in milk. In addition, nontuberculous or atypical mycobacteria infections are an emerging diseases to human and animals. Despite the tuberculin test represents the main in vivo diagnostic method to control and eradication of the bovine disease worldwide, few studies have focused the elimination of mycobacteria in milk from cows positive to the tuberculin tests. The aim of this study was to identify Mycobacterium species in milk samples from positive cows to the comparative cervical tuberculin test. A pool of milk from all quarters of 142 (2.97%) positive cows from 4,766 animals submitted to comparative cervical tuberculin test was aseptically collected and cultivated aerobically onto Lowenstein-Jensen and Stonebrink media, kept for up to 90 days. The colonies were subjected to Ziehl-Neelsen stain for detecting acidfast bacilli (AFB) and molecular classification. Fourteen strains were isolated from 12 cows (n=12/142; 8.4%) and species identified by polymerase chain reaction with restriction enzymes (PCR-PRA) were: M. mucogenicum type 2 (n=4), M. nonchromogenicum type 1 (n=3), M. hodleri type 1 (n=2), M. terrae type 3 (n=3), M. cookii (n=1), and M. szulgai (n=1). The sequencing of hsp65 gene identified mycobacteria species in the 14 isolates with an identity higher than 98%, as follow: Sequencing of 14 isolates allowed identify the followed species: M. engbaekii (n=5), M. arupense (n=4), M. nonchromogenicum (n=3), and M. heraklionense (n=2). There was concordance of mycobacterial typing between PCR-PRA and sequencing only to M. nonchromogenicum species (n=3/14; 21.4%). The phylogenetic tree and dendogram of 14 isolates showed four clusters and three subclusters, respectively, identified as nontuberculous mycobacteria grouped in Mycobacterium terrae complex. Despite the absence of species of the M. tuberculosis complex in milk samples, the identification of nontuberculous or atypical mycobacteria highlights the risk of pathogen transmission from bovine-to-humans through milk or dairy products, since many of mycobacterial species described here have been reported causing pulmonary and extrapulmonary diseases both in immunocompetent and immunocompromised people.