Análise dos efeitos de associações das aminas biogênicas cadaverina e putrescina sobre cultura de fibroblasto de anfíbios e células hepáticas humanas, cultivadas em sistema 2D

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Data

2022-08-24

Autores

Gonçalves, Letícia Rocha [UNESP]

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Editor

Universidade Estadual Paulista (Unesp)

Resumo

A problemática ambiental promovida pelo desenvolvimento da sociedade humana é um dos grandes desafios do século XXI. Dentre as principais fontes antrópicas de contaminação ambiental, estão os cemitérios. O principal contaminante desses ambientes é um líquido tóxico, derivado da putrefação cadavérica, denominado de necrochorume. Neste líquido são encontrados contaminantes químicos orgânicos e inorgânicos e biológicos, altamente detrimentais à saúde humana, à biota endêmica (incluindo à vida animal) e ao ambiente adjacente. O potencial tóxico do necrochorume é, principalmente, devido às substâncias orgânicas presentes em sua composição, como as aminas biogênicas, cadaverina (CAD) e putrescina (PUT). Ambas, são naturalmente sintetizadas por praticamente todos os seres vivos em concentrações micromolares e apresentam funções essenciais nos processos de diferenciação, crescimento e morte celular dos organismos. Contudo, em altas concentrações têm potencial citogenotóxico e até carcinogênico. Todos os compostos gerados durante a decomposição dos corpos podem contaminar o solo e os recursos hídricos (águas subterrâneas e superficiais) podendo persistir no ambiente por tempos variáveis, o que confere um alto potencial contaminante para o necrochorume. Por toda essa problemática somada ao aumento no número de mortes pela pandemia da COVID-19, torna-se necessário o desenvolvimento de mais estudos de ampla abordagem dos impactos do necrochorume sobre a saúde ambiental. No presente estudo, foram consultadas bases de dados científicos eletrônicos (NCBI); publicações de agências governamentais (por exemplo, ARPEN, Brasil); agências ambientais (por exemplo, OMS, OurWorldInData.org); sites confiáveis disponíveis gratuitamente (por exemplo, CNN); e revistas científicas relacionadas ao tema, para levantar informações sobre os impactos de contaminantes de cemitérios sobre a biota e saúde humana, bem como os impactos da pandemia na geração desses contaminantes. Foram desenvolvidos ainda estudos do potencial tóxico de associações das duas aminas biogênicas (CAD e PUT) presentes no principal contaminante de cemitérios (necrochorume), para melhor avaliar o modo de ação conjunta dessas substâncias. Linhagens celulares de anfíbio e de seres humanos foram expostas a diferentes associações dessas aminas, para avaliação da citogenotoxicidade e do potencial mutagênico (ensaios da resazurina, cometa e micronúcleo) das mesmas. Foi também avaliado, com as mesmas linhagens celulares, o perfil do ciclo celular, por citometria de fluxo, e o indicativo de morte das células, pela fragmentação do DNA da associação de CAD e PUT. A linhagem HepG2/C3A ainda foi submetida aos ensaios de avaliação da expressão gênica, para os genes relacionados a via de estresse oxidativo (CAT, SOD1A1, GSTM4, GSR), metabolismo de xenobiontes (CYP1A1), reparo do DNA (ERCC e CHECK1), morte celular (p53 e c-MyC) e apoptose (caspase 3 e capsase 9) (dados adicionais). Os resultados obtidos com a linhagem celular Speedy indicaram citotoxicidade para as associações de maiores concentrações de CAD (20 e 10%) e PUT (10 e 0,1%), igualmente para as associações com 20% de CAD e com 10% de PUT, independente da concentração da bioamina associada. Em baixas concentrações, as aminas testadas induziram efeito aneugênico sobre as células Speedy, quando em exposição por 24 h. Já para as exposições celulares de 48h, a concentração mais alta das aminas (CAD 20% e PUT 10%) induziu fragmentação do DNA e parada do ciclo celular na fase S. Assim, os efeitos tóxicos, para a linhagem celular Speedy, foi tempo dependente da exposição. Em relação à linhagem celular HepG2/C3A, as associações de CAD e PUT no tempo de 24 h de exposição indicaram genotoxicidade e indicativo de potencial mutagênico por efeitos de origem aneugênica e clastogênica para todas as concentrações testadas CAD (20 e 30%), associada a PUT (10 e 30%) e ainda nessas mesmas concentrações foi observado uma diminuição na expressão dos genes CHECK1,CAT, GSTM4, GSR, CYP1A, p53, c-MyC, caspase 3 e capsase 9 e aumento da expressão dos genes ERCC1 para CAD (20 e 30%) associada a PUT (10%) e SOD1A para CAD (20%) e PUT (30%). Análises em citômetro de fluxo indicaram fragmentação no DNA no tempo de 24h e 48h de exposição para a concentração de CAD (30%) e PUT (70%). Essas informações comprovam os perigos das aminas presentes no necrochorume, tanto à saúde como ao ambiente, portanto alertam sobre os impactos negativos das contaminações de áreas cemiteriais. Os ensaios com as células Speedy e HepG2/C3A mostraram que as aminas biogênicas aqui avaliadas são potencialmente genotóxicas e com potencial mutagênico para diferentes vertebrados, indicando que podem desencadear problemas à saúde de trabalhadores, visitantes, da população e de todo ecossistema que vive no entorno de cemitérios.
The environmental crisis caused by the societal developments of humans is one of the great challenges of the 21st century. Cemeteries are one of the main anthropogenic sources of environmental contamination. The main contaminant from cemeteries is a toxic liquid derived from cadaveric putrefaction called cemetery leachate. This liquid contains organic and inorganic chemical contaminants which are highly detrimental to human health, to endemic biota (including animal life), and to the adjacent environment. The toxic potential of cemetery leachate is mainly due to the organic substances present in its composition, such as the biogenic amines cadaverine (CAD) and putrescine (PUT). Both substances are naturally synthesized by almost all living beings in micromolar concentrations and they are essential to the processes of differentiation, growth, and cell death of organisms. However, in high concentrations, they can be their cytogenotoxic and even carcinogenic potential. All of the compounds generated during the decomposition of the bodies can contaminate the soil and water resources (ground and surface water), can persist in the environment for varying lengths of time o que confere um alto potencial contaminante para o necrochorume. Because these serious problems add ao increase in the number of deaths from the COVID-19, became necessary to develop more studies with broader scopes on the impacts of cemetery leachate on environmental health. The present study consulted electronic scientific databases (NCBI); publications from government agencies (e.g. ARPEN, Brazil); environmental agencies (e.g. WHO, OurWorldInData.org); freely available trusted websites (e.g. CNN); and scientific journals related to the topic in order to gather information on the impacts of contaminants from cemeteries on biota and human health, as well as the impacts of the pandemic on the generation of these contaminants. Studies on the toxic potential of associations of the two biogenic amines (CAD and PUT) present in the main contaminant of cemeteries (cemetery leachate) were also carried out, in order to better evaluate the joint mode of action of these substances. Amphibian and human cell lines were exposed to different associations of these amines, in order to evaluate their cytogenotoxicity and mutagenic potential (resazurin, comet, and micronucleus assays). The cell cycle profile was evaluated using flow cytometry, and the indication of cell death was also evaluated using the fragmentation of the association DNA of CAD and PUT on the same cell lines. The HepG2/C3A lineage was submitted to gene expression evaluation assays on genes related to the oxidative stress pathway (CAT, SOD1A1, GSTM4, GSR), xenobiont metabolism (CYP1A1), DNA repair (ERCC and CHECK1), cell death (p53 and c- MyC) and apoptosis (caspase 3 and capsase 9) (additional data). The results obtained with Speedy cell lineage indicated cytotoxicity for the associations with the highest concentrations of CAD (20 and 10%) and PUT (10 and 0.1%), equally for the associations with 20% of CAD and with 10% of PUT, regardless of the concentration of the associated bioamine. At low concentrations, the tested amines induced an aneugenic effect on Speedy cells when exposed for 24 h. For cell exposures of 48h, the highest concentration of amines (CAD 20% and PUT 10%) induced DNA fragmentation and cell cycle arrest in S phase. Thus, the toxic effects for the Speedy cell line were time exposure dependent. In relation to the HepG2/C3A cell line, at 24 h of exposure, the associations of CAD and PUT indicated genotoxicity with an indication of mutagenic potential may be of both aneugenic and clastogenic origin, for all concentrations tested CAD (20 and 30%), associated PUT (10 and 30%). And even at these same concentrations, a decrease in the expression of the genes CHECK1,CAT, GSTM4, GSR, CYP1A, p53, c-MyC, caspase 3 and capsase 9 was observed and an increase in the expression of the ERCC1, for CAD (20 and 30%) associated with to PUT (10%), and SOD1A genes, for CAD (20%) and PUT (30%). Flow cytometer analysis indicated DNA fragmentation at 24h and 48h exposure time for the concentration of CAD (30%) and PUT (70%). This study provides information that proves the dangers of the amines present in cemetery leachate, both to health and to the environment, therefore sounding an alert about the negative impacts of the contamination of cemetery areas. The study also shows that molecular assays, such as gene expression, undertaken using the, may help to better understand the effects of the biogenic amines in cemetery leachate. Assays with Speedy HepG2/C3A cell lines showed that the biogenic amines evaluated here are potentially genotoxic and have mutagenic potential for humans, indicating that they can trigger health problems for workers, visitors, the population and de todo ecossistema living around cemeteries.

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Palavras-chave

Citogenotoxicidade, Citometria de fluxo, Expressão gênica, Impactos ambientais da COVID-19, Linhagem HepG2/C3A, Linhagem speedy, Necrochorume, Cemetery leachate, Cytogenotoxicity, Flow cytometry, Gene expression, HepG2/C3A lineage, Speedy lineage, Environmental impacts of COVID- 19

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