Construção de um sistema de amplificação de sinal para riboreguladores

Abstract

Dengue e Zika são arbovírus do gênero Flavivirus e representam um risco de infecção para milhões de pessoas no mundo. Em 2019, o número de casos prováveis para essas doenças no Brasil aumentou 650% no caso da Dengue e 65% para Zika quando comparado ao ano anterior. Mesmo com a grande incidência o número de casos confirmados em laboratório (por sorologia ou detecção nucleica) é baixo, principalmente por detecção nucleica. Atualmente o diagnóstico preciso para esses arbovírus é feito por técnicas de ELISA e RT-PCR, esses procedimentos exigem uma estrutura laboratorial específica e a manipulação por profissionais tornando-os dispendiosos e morosos. Além disso, a estrutura laboratorial exigida inviabiliza o diagnóstico em regiões remotas do Brasil e também em outros países tropicais afetados. Este trabalho visou desenvolver circuitos sintéticos de DNA que sirvam para a identificação rápida e simples do RNA viral in vitro. Riboreguladores específicos, do tipo Toehold Switch, previamente desenvolvidos no grupo de pesquisa SynBio AQA denominados switch DENV10550(2) e switch ZIKV1440(2.6) capazes de detectar o RNA viral (RNA trigger) referente, respectivamente, aos vírus da Dengue e da Zika foram utilizados. Os riboreguladores foram empregados em 3 diferentes estratégias de amplificação de sinal: uma baseada na protease Mf-Lon, outra baseada na enzima T7 RNA polimerase e a terceira com base em uma integrase do tipo serina. A funcionalidade dos dispositivos foi avaliada por reações de transcrição e tradução in vitro na presença do RNA trigger sintético específico ou inespecífico. A ativação dos sistemas T7 RNApol foi medida pela atividade da proteína repórter luciferase. Nos dispositivos da protease Mf-Lon se utilizou a proteína fluorescente verde fusionada a cauda de degradação pdt#5 (específica à protease) para avaliar a resposta. Os ensaios com os sistemas Mf-Lon indicaram uma degradação baixa da proteína repórter, nota-se que a perda da fluorescência observada se deu, principalmente, por quenching da GFP após repetidos ciclos de excitação. Para o sistema amplificação baseado na integrase, devido a adversidades, não foi possível a construção da unidade de resposta. Construiu-se apenas os plasmídeos de detecção com a Int13 e com a Int9. Estes contêm o switch DENV10550(2) controlando o gene da integrase. Para o sistema T7 RNApol, a amplitude de ativação máxima foi obtida com o dispositivo separado em dois plasmídeos e empregando o switch DENV10550(2), atingiu-se uma amplitude de ativação 2,29 vezes maior na presença de 500 ng de RNA trigger específico (trigger DENV10550) em relação à reação com o trigger inespecífico. O dispositivo com o switch ZIKV1440(2.6) neste mesmo sistema apresentou uma amplitude de ativação menor quando empregado o RNA trigger específico (trigger ZIKV1440) em relação à resposta com o trigger inespecífico (trigger DENV10550), devido a esse fato reavaliou-se os switches utilizados no trabalho e constatou-se que o switch ZIKV1440(2.6) não é funcional. A resposta do dispositivo T7 RNApol com o switch DENV10550(2) mostra a funcionalidade e especificidade desta estratégia de sinalização, no entanto, a amplitude de ativação atingida foi pouco superior à alcançada no dispositivo com circuito direto de resposta.

Dengue and Zika are arboviruses of the Flavivirus genus and represent a risk of infection for millions of people worldwide. In Brazil, 2019, the number of reports for these diseases increased by 650% for Dengue and 65% for Zika compared to the previous year. Even with the high incidence the number of precise confirmed cases (by serology or molecular detection) is low. Currently, the precise diagnosis of these arboviruses is made by techniques such as ELISA and RT-PCR, that require particular laboratory resources and the handling by technicians, which makes the diagnosis expensive and time-consuming. In addition, the demanded laboratory structure makes the diagnosis impracticable in remote regions of Brazil and also in other affected tropical countries. This work aimed to develop a synthetic DNA circuit for the rapid and simple identification of viral RNA from Zika and Dengue in an in vitro gene expression system. Toehold Switch previously developed in the SynBio AQA research group (called switch DENV10550(2) and switch ZIKV1440(2.6)) capable of detecting, individually, the viral RNA (trigger RNA) to the two diseases were employed. These riboregulators were used in 3 different signal amplification strategies: one based on the Mf-Lon protease, another based on the T7 RNA polymerase enzyme, and the third in a system using serine-type integrase. In vitro gene expression reactions are performed to evaluate the response of the synthetic circuits in the presence of specific and non-specific trigger RNA. The activation of the T7 RNApol systems was measured by the activity of reporter protein luciferase. In the evaluation of the Mf-Lon protease circuit, the green fluorescent protein fused to the degradation tail pdt#5 was used to assess the response. The Mf-Lon protease system in vitro gene expression assays did not indicate high degradation rates of the reporter protein, the fluorescence loss observed was, mainly, due to GFP quenching after repeated excitation cycles. For the signal amplification system based on serine-type integrase, due to several adversities, it was not possible to build the response unit. Only the detection plasmids with the integrase Int13 and Int9 were constructed. These contain the DENV10550(2) switch controlling the integrase gene The highest fold change observed in the T7 RNApol system was with the circuit separated in two plasmids and employing the DENV10550(2) switch, a response 2.29 times greater was achieved in the presence of 500 ng of RNA specific trigger (trigger DENV10550) in comparison to the response with the non-specific RNA. The T7 RNApol system with the ZIKV1440(2.6) showed a smaller fold change to the specific RNA trigger (trigger ZIKV1440) in relation to the response with the non-specific RNA trigger (trigger DENV10550), due to this fact the switches used in the work were re-evaluated, and it was found that the ZIKV1440(2.6) switch is not functional. The response of the T7 RNApol device with the DENV10550(2) switch shows the functionality and specificity of this signaling strategy, however, the fold change achieved was slightly higher than that obtained in the device with a direct response circuit.