Avaliação dos efeitos antineoplásicos do extrato bruto e frações de folhas de Psidium guajava em linhagens celulares humanas de glioblastoma

Abstract

Psidium guajava (goiaba) é uma árvore frutífera usada na medicina popular, por suas propriedades anti-inflamatórias, antidiarreicas e cicarizantes, entre outras. Investigações mostram efeitos antitumorais de compostos bioativos de P. guajava, mas há escassez de estudos que avaliam sua ação terapêutica no glioblastoma (GBM). O GBM é um tumor primário cerebral com baixa sobrevida e alta taxa de mortalidade, nesse sentido, a investigação de novos compostos que regulem a tumorigênese é estimulada. O objetivo deste projeto consistiu em padronizar o extrato de folhas de P. guajava e avaliar o potencial efeito antitumoral em linhagens celulares de GBM (A172 e U87-MG). As propriedades fitoquímicas e antioxidantes do extrato bruto (EB) de P. guajava e frações, foram submetidas a avaliações qualitativas, quantitativas e cromatografias em camada delgada (HPTLC) e líquida (HPLC); e avaliação de citotoxicidade por hemólise. Ensaios de proliferação e viabilidade foram realizados com fração acetato de etila (FAE), selecionada após as análises fitoquímicas, em células endoteliais (EA-hy 926) e tumorais (A172 e U87-MG). O potencial da FAE sobre proliferação, genotoxicidade, inflamação e invasão foi avaliado nas linhagens tumorais. A proteína antiapoptótica (BCL-2), pró-apoptótica (BAX) e metaloproteinases (MMP2 e MMP9) foram analisadas por Western blotting. As proteínas inibidoras do fator nuclear-κB (IKK), Tirosina-Proteína Quinases (JAK1 e JAK3), Proto-Oncogene (MDM2), ativador de transcrição 3 (STAT3) e anexina A1 (AnxA1) foram analisadas por imunocitoquímica. Os níveis de interleucina (IL-6) e interferon gama (INF-γ) foram quantificados no sobrenadante do lisado celular e no meio de cultivo. A análise da expressão gênica de TP53, NFkB e mTOR foi avaliada por RT-PCR. A análise cromatográfica confirmou a presença de Quercetina, Ácido Gálico, Catequina e Miricetina. O teste de hemólise indicou ausência de citotoxicidade nas concentrações testadas. Após os testes de viabilidade e citotoxicidade, determinou-sea concentração de 25% para A172 e 15% para a U87-MG em 24 horas. O tratamento com a FAE não alterou a morfologia das células endotelias e tumorais; no entanto, observou-se efeito inibitório da proliferação celular da linhagem A172 após o tratamento com FAE na concentração de 25% e nas linhagens U87-MG e EA-hy926 na concentração de 15% em 24 horas. Ainda, o tratamento com a FAE nas linhagens tumorais, A172 e U87-MG, promoveu danos significativos ao DNA. Em A172, o tratamento com FAE induziu INF-γ no sobrenadante do lisado; no entanto, reduziu nosobrenadante do meio de cultivo. Em U87-MG, o tratamento reduziu INF-γ no sobrenadante do lisado; bem como no sobrenadante do meio. O tratamento não alterou a expressão de IL-6 no sobrenadante do lisado celular em ambas as linhagens. Entretanto, houve redução de IL-6 no sobrenadante do meio de cultivo da A172; bem como aumento de IL-6 no sobrenadante do meio de cultivo da U87-MG. Nas células A172, a FAE induziu AnxA1; contudo, na linhagem U87-MG a FAE reduziu significativamente a expressão dessa proteína. A expressão de IKK foi aumentada em ambas as linhagens. A expressão de JAK1 e JAK3 foi reduzida em A172 e U87-MG. A expressão de MDM2, aumentou em A172 e reduziu em U87-MG. STAT3 aumentou em A172 e reduziu na U87-MG. No sobrenadante do lisado celular, a expressão de AnxA1 foi induzida em A172; no entanto, foi reduzida em U87-MG após o tratamento com FAE. BAX não foi alterada significativamente. MMP2 e MMP9 foram reduzidas em A172. A expressão proteica de MMP2 e MMP9 foi induzida em U87-MG. O tratamento com FAE reduziu a expressão dos genes mTOR, TP53 e NFkB nas linhagens A172 e U87-MG. FAE induziu a morte celular nas linhagens tumorais. O tratamento com a FAE inibiu a proliferação celular, induziu a apotose e regulou mediadores envolvidos na tumorigênese, com potencial para ser explorada em pesquisas futuras.

Psidium guajava (guava) is a fruit tree used in folk medicine, for its anti-inflammatory, antidiarrheal and healing properties, among others. Investigations show antitumor effects of bioactive compounds from P. guajava, but there is a lack of studies evaluating their therapeutic action in glioblastoma (GBM). GBM is a primary brain tumor with low survival and high mortality rate, in this sense, the investigation of new compounds that regulate tumorigenesis is stimulated. The objective of this project was to standardize the P. guajava leaf extract and evaluate the potential antitumor effect on GBM cell lines (A172 and U87-MG). The phytochemical and antioxidant properties of the crude extract (EB) of P. guajava and fractions were subjected to qualitative and quantitative evaluations and thin layer chromatography (HPTLC) and liquid chromatography (HPLC) and evaluation of cytotoxicity due to hemolysis. Proliferation and viability assays were performed with ethyl acetate fraction (FAE), selected after phytochemical analysis, on endothelial (EA-hy 926) and tumor cells (A172 and U87- MG). The potential of FAE on proliferation, genotoxicity, inflammation and invasion was evaluated in tumor cell lines. Antiapoptotic protein (BCL-2), proapoptotic protein (BAX) and metalloproteinases (MMP2 and MMP9) were analyzed by Western blotting. The inhibitory proteins of nuclear factor-κB (IKK), Tyrosine-Protein Kinases (JAK1 and JAK3), Proto-Oncogene (MDM2), activator of transcription 3 (STAT3) and annexin A1 (AnxA1) were analyzed by immunocytochemistry. The levels of interleukin (IL-6) and interferon gamma (INF-γ) were quantified in the cell lysate supernatant and in the culture medium. Chromatographic analysis confirmed the presence of Quercetin, Gallic Acid, Catechin and Myricetin. The hemolysis test indicated no cytotoxicity at the concentrations tested. After viability and cytotoxicity tests, a concentration of 25% for A172 and 15% for U87-MG was determined in 24 hours. Treatment with FAE did not change the morphology of endothelial and tumor cells; however, an inhibitory effect on cell proliferation was observed in the A172 line after treatment with FAE at a concentration of 25% and in the U87-MG and EA-hy926 lines at a concentration of 15% within 24 hours. Furthermore, treatment with FAE in tumor lines, A172 and U87- MG, caused significant damage to DNA. In A172, FAE treatment induced INF-γ in the lysate supernatant; however, it was reduced in the culture medium supernatant. In U87-MG, treatment reduced INF-γ in the lysate supernatant, as well as in the medium supernatant. The treatment did not change the expression of IL-6 in the cell lysa supernatant in both lines. However, there was a reduction in IL-6 in the supernatant of the A172 culture medium; as well as an increase in IL-6 in the supernatant of the U87- MG culture medium. In A172 cells, FAE induced AnxA1; however, in the U87-MG line FAE significantly reduced the expression of this protein. IKK expression was increased in both lines. The expression of JAK1 and JAK3 was reduced in A172 and U87-MG. MDM2 expression increased in A172 and reduced in U87-MG. STAT3 increased in A172 and reduced in U87-MG. In the cell lysate supernatant, AnxA1 expression was induced in A172; however, it was reduced in U87-MG after FAE treatment. BAX was not significantly changed. MMP2 and MMP9 were reduced in A172. Protein expression of MMP2 and MMP9 was induced in U87-MG. Treatment with FAE reduced the expression of mTOR, TP53 and NFkB genes in lines A172 and U87-MG. FAE induced cell death in tumor cells. Treatment with FAE inhibited cell proliferation, induced apotosis and regulated mediators involved in tumorigenesis, with potential to be explored in future research.