Avaliação da ação da triiodotironina (T3) no sistema purinérgico, com participação de vias extranucleares, em adipócitos subcutâneos humanos in vitro

Abstract

A obesidade está associada ao desenvolvimento de inflamação crônica no tecido adiposo branco (TAB) e a uma maior produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), resultando em elevados níveis de estresse oxidativo. O TAB armazena energia na forma de triacilglicerol (TAG), que ao sofrer lipólise, é hidrolisado em ácidos graxos livres (FFA) e glicerol. O hormônio tireoidiano T3 regula a taxa metabólica basal, estimula a lipólise, aumenta a produção de adenosina 5'-trifosfato (ATP) e a produção de calor, regulando a termogênese. Sabe-se que o T3 modula a transcrição gênica e tradução proteica por meio das vias citoplasmáticas da fosfatidilinositol 3 quinase (PI3K) e/ou proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK) no TAB. A molécula de ATP pode ou não ser hidrolisada por ação de ecto-enzimas. O ATP e seus derivados atuam no meio extracelular sinalizando por meio dos receptores purinérgicos, expressos no TAB, regulando o metabolismo lipídico. O receptor P2X7 é sensível ao ATP e, quando ativado, é capaz de modular o metabolismo lipídico, adipogênese, lipólise e inflamação. Existe uma importante relação entre o hormônio tireoidiano e a sinalização purinérgica em diferentes sistemas fisiológicos e patológicos, mas essa relação ainda é pouco elucidada na literatura, especialmente no TAB. Nosso trabalho tem como objetivo demonstrar a relação existente entre a ação do T3 na modulação da sinalização purinérgica em adipócitos subcutâneos humanos, bem como determinar se essa ação é mediada por mecanismos não nucleares, por meio das vias MAPK/ERK e PI3K. Para isso, pré-adipócitos humanos (HPAd-802s-05A), após a diferenciação, foram submetidos ao tratamento com T3 (10nM) por 24 horas, na presença ou ausência de inibidores das vias MAPK/ERK (PD98059, 5 μM) e PI3K (LY294002, 5 μM). Os seguintes parâmetros foram analisados: viabilidade celular (MTT, LDH e contagem nuclear), acúmulo lipídico (coloração Oil Red), lipólise basal (ensaio de ácidos graxos livres e glicerol), estresse oxidativo (dosagens de malonaldeído e carbonilação proteica), expressão proteica dos receptores purinérgicos P2 e ectonucleotidases (imunofluorescência), quantificação do ATP extracelular (ensaio de bioluminescência luciferina-luciferase HS II) e liberação/acúmulo extracelular de adenosina (ADO) (cromatografia líquida de ultra performance - UHPLC). Demonstramos que o T3 desempenha um papel importante na redução da expressão de NTPDase1, NTPDase3 e ecto-5'-nucleotidase, resultando no aumento da concentração extracelular de ATP. Evidenciamos também que o hormônio aumentou a expressão do receptor P2X7, acompanhado de uma maior liberação/acúmulo de ATP extracelular, e esses efeitos foram abolidos pelo bloqueio das vias MAPK/ERK e PI3K. Com isso, evidenciamos que o T3 modula a sinalização ATP/P2X7 por meio das vias MAPK e PI3K em adipócitos subcutâneos humanos.

Obesity is associated with the development of chronic inflammation in white adipose tissue (WAT) and increased production of reactive oxygen species (ROS), resulting in high levels of oxidative stress. TAB stores energy in the form of triacylglycerol (TAG), which, upon undergoing lipolysis, is hydrolyzed into free fatty acids (FFA) and glycerol. The thyroid hormone T3 regulates the basal metabolic rate, stimulates lipolysis, increases the production of adenosine 5'-triphosphate (ATP) and heat production, regulating thermogenesis. It is known that T3 modulates gene transcription and protein translation through the cytoplasmic phosphatidylinositol 3 kinase (PI3K) and/or mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathways in WAT. The ATP molecule may or may not be hydrolyzed by the action of ecto-enzymes. ATP and its derivatives act in the extracellular environment, signaling through purinergic receptors, expressed in the WAT, regulating lipid metabolism. The P2X7 receptor is sensitive to ATP and, when activated, is capable of modulating lipid metabolism, adipogenesis, lipolysis and inflammation. There is an important relationship between thyroid hormone and purinergic signaling in different physiological and pathological systems, but this relationship is still poorly understood in the literature, especially in WAT. Our work aims to demonstrate the relationship between the action of T3 in modulating purinergic signaling in human subcutaneous adipocytes, as well as determining whether this action is mediated by non-nuclear mechanisms, through the MAPK/ERK and PI3K pathways. For this, human pre-adipocytes (HPAd-802s-05A), after differentiation, were subjected to treatment with T3 (10nM) for 24 hours, in the presence or absence of MAPK/ERK pathway inhibitors (PD98059, 5 μM) and PI3K (LY294002, 5 μM). The following parameters were analyzed: cell viability (MTT, LDH e number of nuclei), lipid accumulation (Oil Red staining), basal lipolysis (free fatty acid and glycerol assay), oxidative stress (measurements of malonaldehyde and protein carbonylation), protein expression of purinergic receptors P2 and ectonucleotidases (immunofluorescence), quantification of extracellular ATP (luciferin-luciferase HS II bioluminescence assay) and extracellular release/accumulation of adenosine (ADO) (ultraperformance liquid chromatography - UHPLC). We demonstrate that T3 plays an important role in reducing the expression of NTPDase1, NTPDase3 and ecto-5'-nucleotidase, resulting in increased extracellular ATP concentration. We also showed that the hormone increased the expression of the P2X7 receptor, accompanied by a greater release/accumulation of extracellular ATP, and these effects were abolished by blocking the MAPK/ERK and PI3K pathways. With this, we demonstrated that T3 modulates ATP/P2X7 signaling through the MAPK and PI3K pathways in human subcutaneous adipocytes.