Interação e atividade das NETs sobre o Vírus Sincicial Respiratório Humano (hRSV) em modelo in vitro

Abstract

O Vírus Sincicial Respiratório (hRSV) é o principal agente etiológico das infecções virais agudas do trato respiratório inferior, resultando em mais de 3 milhões de casos muito graves de bronquiolite todo o ano. Durante a infecção, os neutrófilos são massivamente recrutados ao local infeccioso, onde são estimulados a liberarem as NETs. Estas estruturas são compostas por DNA complexado a diferentes proteínas e enzimas. O hRSV é capaz de induzir a formação das NETs através da sua proteína F. Embora ainda não esteja claro qual seria o ligante das NETs para o RSV, estas estruturas apresentam ação virucida sobre o referido microrganismo. Neste trabalho, procuramos identificar um ligante das NETs para o hRSV, bem como, expandir o entendimento do impacto de diferentes proteases no curso da infecção in vitro para isolados clínicos e laboratoriais. Ensaios de Western blotting e imunoprecipitação apontaram interação do hRSV com uma banda de 50-75kDa presente nas NETs, identificada como mieloperoxidase (MPO) através de análises de sequenciamento de peptídeos e Western blotting. MPO purificada foi capaz de interagir com hRSV e o inibidor enzimático de MPO (PF-06281355) foi capaz de inibir sua ação virucida frente a isolados laboratoriais e clínicos do vírus. À exemplo de MPO, a atividade virucida de elastase e catepsina-G, bem como das NETs, foi estendida aos isolados clínicos. Os inibidores enzimáticos de todas as enzimas citadas acima bloquearam a ação virucida das enzimas e das NETs. Estes resultados, em conjunto com aqueles previamente descritos na literatura, demonstram que o efeito virucida das NETs se aplica a isolados laboratoriais e clínicos do hRSV, e que os mecanismos moleculares desta atividade envolvem a interação de hRSV com MPO, bem como a ação enzimática dela e de outras enzimas como elastase e catepsina G. O avanço dos estudos sobre a interação das NETs com o hRSV contribui para o entendimento dos efeitos benéficos ou deletérios das NETs no curso da infecção, possibilitando assim o desenvolvimento de novas estratégias que visem o bem estar e a qualidade de vida do paciente infectado.

Respiratory Syncytial Virus (hRSV) is the primary etiological agent of acute viral infections in the lower respiratory tract, resulting in over 3 million severe cases of bronchiolitis every year. During infection, neutrophils are massively recruited to the infectious site, where they are stimulated to release NETs. These structures are composed of DNA complexed with various proteins and enzymes. hRSV can induce the formation of NETs through its F protein. Although it is not yet clear what the NETs' ligand for RSV would be, these structures exhibit virucidal action against the mentioned microorganism. In this study, we sought to identify a ligand for NETs in hRSV, as well as expand the understanding of the impact of different proteases during in vitro infection for clinical and laboratory isolates. Western blotting and immunoprecipitation assays indicated an interaction between hRSV and a 50-75kDa band present in NETs, identified as myeloperoxidase (MPO) through peptide sequencing and Western blotting analyses. Purified MPO was able to interact with hRSV, and the enzymatic inhibitor of MPO (PF-06281355) was able to inhibit its virucidal action against laboratory and clinical isolates of the virus. Similar to MPO, the virucidal activity of elastase and cathepsin-G, as well as NETs, was extended to clinical isolates. Enzymatic inhibitors of all the mentioned enzymes above blocked the virucidal action of the enzymes and NETs. These results, in conjunction with those previously described in the literature, demonstrate that the virucidal effect of NETs applies to both laboratory and clinical isolates of hRSV, and the molecular mechanisms of this activity involve the interaction of hRSV with MPO, as well as its enzymatic action and that of other enzymes like elastase and cathepsin G. Advancing studies on the interaction of NETs with hRSV contributes to the understanding of the beneficial or deleterious effects of NETs during infection, thus enabling the development of new strategies aimed at the well-being and quality of life of infected patients.