Desenvolvimento de uma matriz cromatográfica para purificação de F(ab')2 específicas do antiveneno botrópico comercial

Abstract

Acidentes ofídicos são uma emergência médica potencialmente fatal resultante do envenenamento por picadas de serpentes. Considerada pela Organização Mundial da Saúde (OMS) como uma doença tropical negligenciada, afeta aproximadamente 28 mil brasileiros por ano. As serpentes do gênero Bothrops são as mais importantes epidemiologicamente no Brasil e a fisiopatologia desse tipo de acidente inclui mecanismos proteolíticos, coagulantes e hemorrágicos, com manifestações locais e/ou sistêmicas. O único tratamento eficaz é a soroterapia e esta pode levar a efeitos adversos, como reações anafiláticas e doença do soro, que se relacionam às práticas de fabricação e pureza do antiveneno. O objetivo deste trabalho foi desenvolver uma matriz cromatográfica de afinidade capaz de purificar a fração F(ab’)2 do antiveneno botrópico comercial que apresenta especificidade com as toxinas do veneno de Bothrops jararaca e avaliar a capacidade de ligação antígeno-anticorpo desta fração. Para isso, foi desenvolvida uma matriz cromatográfica de afinidade tendo como ligante específico o veneno de Bothrops jararaca acoplado à resina comercial Sepharose CNBr 4B. Em seguida, foram realizados ensaios cromatográficos utilizando a matriz acoplada a um equipamento de baixa pressão a partir da eluição do soro antibotrópico comercial (SABC) e análises por espectrometria de massas para identificar o perfil proteico contido na matriz cromatográfica e da fração F(ab’)2 isolada. A avaliação da capacidade de ligação entre toxinas e fração isolada foi realizada através de ensaios de ELISA indireto. Como resultados, a matriz proposta foi capaz de purificar a fração F(ab’)2 do SABC que apresenta maior especificidade com as toxinas botrópicas do veneno ofídico. Os fragmentos F(ab’)2 purificados e caracterizados proteômicamente possuem 68% de proteínas terapeuticamente relevantes, enquanto o SABC bruto apenas 45%. Os ensaios de ELISA demonstraram que a fração F(ab’)2 purificada manteve a capacidade de ligação quando comparada com o SABC. A presente proposta evidencia que a matriz cromatográfica de afinidade elaborada é eficaz na obtenção de anticorpos específicos e estes podem ser utilizados no desenvolvimento de estratégias diagnósticas para acidentes ofídicos brasileiros. Além disso, os achados deste trabalho podem suportar estudos mais aprofundados pelos centros produtores para o enriquecimento dos antivenenos botrópicos comerciais através da inclusão de uma etapa cromatográfica adicional no processo de produção dos mesmos.

Snakebites are a potentially fatal medical emergency resulting from snake venom poisoning. The World Health Organization (WHO) considers it a neglected tropical disease, affecting approximately 28 thousand Brazilians per year. Snakes of the genus Bothrops are the most epidemiologically significant in Brazil, and the pathophysiology of these envenomations includes proteolytic, coagulant, and hemorrhagic mechanisms, with local and/or systemic manifestations. The only effective treatment is serum therapy, which can lead to adverse effects such as anaphylactic reactions and serum sickness, both related to the manufacturing practices and purity of the antivenom. The objective of this study was to develop a chromatographic matrix capable of purifying the F(ab')2 fraction of commercial Bothrops antivenom, ensuring specificity with the toxins of Bothrops jararaca venom, and to evaluate the antigen-antibody binding capacity of this fraction. To achieve this, a chromatographic matrix was developed with Bothrops jararaca venom as a specific ligand coupled to the commercial resin Sepharose CNBr 4B. Chromatographic analyses were then conducted using the matrix coupled to low-pressure equipment for the elution of commercial antibotropic serum (SABC) and mass spectrometry analyses to identify the protein profile of the chromatographic matrix and the isolated F(ab')2 fraction. The binding capacity was evaluated through indirect ELISA assays. The results showed that the proposed matrix was able to purify the F(ab')2 fraction of SABC, which has greater specificity for Bothrops venom toxins. The purified F(ab')2 fragments, characterized proteomically, contain 68% therapeutically relevant proteins, compared to 45% in the crude SABC. ELISA assays found that the purified F(ab')2 fraction maintained binding capacity when compared to SABC. This study demonstrates that an elaborate chromatographic matrix is effective in providing specific antibodies, which can be used in the development of diagnostic strategies for Brazilian snakebites. Furthermore, the results can support further studies by production centers aiming to enrich commercial Bothrops antivenoms through the inclusion of an additional chromatographic step in their production process.