Citoplastos receptores produzidos por diferentes técnicas de enucleação na transferência nuclear em bovinos

Abstract

Uma das etapas mais críticas do procedimento de transferência nuclear (TN) é a remoção da cromatina do oócito para a produção de citoplastos. O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito de diferentes ambientes citoplasmáticos obtidos a partir de três técnicas de enucleação (convencional, assistida quimicamente e induzida quimicamente) sobre o remodelamento nuclear e desenvolvimento embrionário, avaliando-se o perfil de expressão dos genes XIST, G6PD e HSPA1A em embriões bovinos. Para isso, quatro experimentos foram delineados. No primeiro experimento, verificou-se que o processo de enucleação pode ser iniciado a partir de 1,0 h de tratamento com demecolcina nas duas técnicas de enucleação química. A dinâmica nuclear e de microtúbulos de oócitos ativados tratados com demecolcina foi avaliada em um segundo experimento, e oócitos tratados apresentaram redução da densidade dos microtúbulos, porém, essas estruturas não desapareceram completamente na maioria dos oócitos. No experimento III, a demecolcina não apresentou efeitos significativos na atividade do fator promotor de maturação (MPF) e da proteína cinase ativada por mitógeno (MAPK) quando utilizada na concentração 0,05μg/mL. No último experimento, a demecolcina não prejudicou o desenvolvimento embrionário e também não alterou o perfil de expressão dos genes XIST, G6PD e HSPA1A em embriões reconstituídos com células embrionárias; porém, quando foram avaliados os níveis de transcritos desses genes em embriões reconstituídos com células somáticas, observou-se maior expressão relativa do XIST e do G6PD em embriões oriundos da técnica de enucleação assistida quimicamente em comparação aos embriões produzidos pela técnica convencional. Portanto, conclui-se que a enucleação química não altera a reprogramação nuclear nem...

Removal of the oocyte chromatin for production of cytoplasts is one of the most critical steps of the standard nuclear transfer (NT) procedure. The aim of this work was to study the effect of different cytoplasmic environments from three enucleation techniques (conventional, chemical-assisted, and chemical-induced enucleation) on nuclear reprogramming and embryonic development, evaluating the expression patterns of XIST, G6PD and HSPA1A genes in bovine embryos. Therefore, four experiments were designed. In the first experiment, it was verified that the enucleation procedure can be initiated 1.0 h after starting demecolcine treatment on both chemical enucleation techniques. The nuclear and microtubular dynamics of activated oocytes treated with demecolcine were evaluated in a second experiment, and treated oocytes showed decreased microtubule density, but these structures did not completely disappear in most oocytes. In experiment III, demecolcine at a concentration of 0.05μg/mL had no significant effect on maturation promoting factor (MPF) and mitogen activated protein kinase (MAPK) activity. In the last experiment, demecolcine had no detrimental effects on embryonic development. Also, the expression patterns of XIST, G6PD and HSPA1A were not altered in reconstituted embryos derived from embryonic donor cells; however, evaluation of transcript levels of these genes in embryos reconstituted using somatic donor cells revealed higher relative expression of XIST and G6PD in embryos derived from chemicalassisted enucleation in comparison to embryos those produced by the conventional technique. In conclusion, chemical enucleation has no effect on nuclear reprogramming and embryonic development after nuclear transfer using embryonic donor cells. Also, chemical-assisted enucleation increases XIST and G6PD expression in nuclear transfer embryos... (Complete abstract click electronic access below)