Análise comparativa dos métodos de quantificação das formas morfológicas de Candida albicans em culturas planctônicas e biofilmes

Abstract

Candida albicans é o principal fungo patógeno que acomete os seres humanos e que apresenta a capacidade de se desenvolver em diferentes morfologias (leveduras, pseudo-hifas e hifas), característica essa denominada de polimorfismo. Esse polimorfismo compromete os métodos de quantificação que requerem precisão e acurácia, como as pesquisas que envolvem fungos filamentosos. O objetivo deste estudo foi comparar os métodos de quantificação de C. albicans por unidades formadoras de colônias (UFC/mL) e por atividade metabólica (Ensaio XTT) com a contagem de células viáveis e de núcleos celulares em Microscópio Confocal. Cepa padrão SC5314 e isolado clínico de C. albicans foram utilizados. Culturas planctônicas padronizadas de cada cepa de C. albicans foram desenvolvidas nas formas de levedura e de filamentos e submetidas a três métodos de quantificação: UFC/mL e contagem celular. Para contagem celular, o Microscópio Confocal foi utilizado com a suspensão fúngica tratada com diferentes marcadores fluorescentes para evidenciar células viáveis, células não viáveis e os núcleos celulares. Biofilmes também foram cultivados em orifícios de placas de 48 poços por 48 horas e foram submetidos aos mesmos testes mencionados para as culturas planctônicas, além do ensaio de XTT. Os dados foram submetidos a uma análise de concordância (Coeficiente de Correlação Intraclasse e Bland-Altman) e de correlação de Spearman (α = 5%) entre os métodos (UFC/mL, contagem celular e XTT). Os resultados demonstraram que não houve concordância (ρ ≤ 0,428) entre o método de UFC/mL e contagem de células para as morfologias de leveduras e filamentos da cepa padrão SC5314 e do isolado clínico de C. albicans, apesar dos métodos terem apresentado alta (rS ≥ 0,884) e significativa (p < 0,001) correlação. Também foi vericado um viés de proporção (p < 0,001) entre esses métodos. Biofilmes de ambas as cepas também apresentaram ausência de concordância (ρ ≤ 0,566) e correlação forte (rS ≥ 0,852) e significativa (p ≤ 0,001) entre os métodos de UFC/mL e células/mL, além de viés de proporção (p < 0,001). Na análise do XTT foi possível visualizar ausência de concordância (p < 0,001), apesar de uma forte e significativa correlação entre os métodos de quantificações (UFC/mL e células/mL). Para todas as morfologias e condições de cultivo, a quantificação por UFC/mL foi menor do que a quantificação por células/mL, sendo então o primeiro um método que subestima a quantificação celular of C. albicans.

Candida albicans is the main human fungal pathogen able to develop in different morphologies (yeasts, pseudo-hyphae and hyphae), a characteristic called polymorphism. This polymorphism undermines quantification methods that require precision and accuracy, such as research involving filamentous fungi. This study aimed to compare the methods of quantifying C. albicans by colony forming units (CFU/mL), and metabolic activity (XTT assay) with viable cell and cell nuclei count in a Confocal Microscope. Reference strains and clinical isolate of C. albicans were used. Standardized planktonic cultures of C. albicans SC5314 were grown as yeast and filaments and subjected to three methods of quantification: CFU/mL and cell count. The confocal microscopy was used for cell counting with the fungal suspension treated with different fluorescent markers to show viable cells, non-viable cells, and cell nuclei. Biofilms were also grown in 48-well plate for 48 hours and subjected to the same quantification methods mentioned for planktonic cultures and the XTT assay. The data were submitted to an analysis of agreement (Intraclass Correlation Coefficient and Bland-Altman) and correlation (α = 5%) between the methods (CFU/mL, cell count and XTT). The results demonstrated no agreement (ρ ≤ 0,428) between the CFU/mL and cells/mL methods for the yeast and filamentous morphologies of both C. albicans strains, although the methods showed high (rS ≥ 0,884) and significant (p < 0,001) correlation. Proportion biases were also verified between the methods for both morphologies. Biofilms of both strains also showed no agreement (ρ ≤ 0,566) and high (rS ≥ 0,852) and significant correlation (p < 0.001) between the CFU/mL and cells/mL 14 methods, which also demonstrated proportion biases (p < 0,001). In the XTT analysis, it was possible to see a lack of agreement (p < 0.001), despite a strong and significant correlation between the quantification methods (CFU/mL and cells/mL). For all morphologies and growth type, the quantification by CFU/mL underestimated cell quantification of C. albicans.