Caracterização estrutural e neutralização enzimática do conjunto de isoformas da Crotoxina B do veneno de Crotalus durissus terrificus

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Data

2022-11-17

Autores

Scarpa, Isabella

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Editor

Universidade Estadual Paulista (Unesp)

Resumo

A subespécie Crotalus durissus terrificus apresenta majoritamente em seu veneno a Crotoxina (CTX), sendo composta por duas subunidades distintas: (I) a Crotoxina A (CA), de caráter ácido e sem atividades enzimática e tóxica, e (II) a Crotoxina B, de caráter básico e com atividades enzimática (fosfolipásica) e tóxica. A soroterapia constitui a base do tratamento das vítimas dos acidentes ofídicos, porém apresenta limitações farmacodinâmicas/farmacocinéticas e efeitos adversos severos, tornando estratégicas as investigações da interação entre toxinas ofídicas e novas moléculas inibidoras. Deste modo, foi buscado o aprofundamento sobre a relação entre estrutura e função do conjunto de isoformas da CB, através de sua caracterização estrutural e neutralização enzimática por inibidores de toxinas ofídicas PLA2-like. O veneno bruto de C.d. terrificus foi fracionado por protocolo otimizado de cromatografia líquida, isolando o conjunto de isoformas de Giroxina e CTX, bem como a fração isolada do conjunto de isoformas de CA e CB. A atividade catalítica do conjunto de isoformas de CB em meios ácido, neutro e básico, com ou sem adição de seu cofator, bem como sua neutralização pelos inibidores de toxinas PLA2-like, foram investigadas por ensaios de atividade hemolítica indireta. A estrutura secundária do conjunto de isoformas da CB em tais meios foi analisada por espectroscopia de dicroísmo circular (CD), evidenciando um espectro de CD padrão de hélices-α. A sua estrutura terciária/quaternária nessas condições foi analisada por espalhamento de luz dinâmico (DLS), sendo possível observar diferentes arranjos oligoméricos. A partir dos índices de polidispersidade observados nos ensaios de DLS, foi selecionado os meios para solubilização da amostra e a temperatura para melhor probabilidade de cristalização do conjunto de isoformas da CB. Essas informações e o refinamento das condições de cristalização da CBa2/CBc, CA2CBb e CBd resultou na obtenção de monocristais provavelmente viáveis para difração de raios X visando futura elucidação estrutural em nível atômico das respectivas isoformas que os compõem.
The Crotalus durissus terrificus subspecies presents mostly Crotoxin (CTX) in its venom, which is composed of two distinct subunits: (I) Crotoxin A (CA), with an acidic character and without enzymatic and toxic activities, and (II) Crotoxin B, of basic character and with enzymatic (phospholipase) and toxic activities. Serotherapy is the basis of treatment for victims of snakebites, but it has pharmacodynamic/pharmacokinetic limitations and severe adverse effects, making investigations of the interaction between snake toxins and new inhibitor molecules strategic. In this way, it was sought to deepen the relationship between structure and function of the set of CB isoforms, through its structural characterization and enzymatic neutralization by inhibitors of PLA2-like snake toxins. The raw venom of C. d. terrificus was fractionated by an optimized liquid chromatography protocol, isolating the set of Gyroxine and CTX isoforms, as well as the isolated fraction of the set of CA and CB isoforms. The catalytic activity of the set of CB isoforms in acidic, neutral and basic media, with or without the addition of its cofactor, as well as its neutralization by inhibitors of PLA2-like toxins, were investigated by indirect hemolytic activity assays. The secondary structure of the CB isoform set in such media was analyzed by circular dichroism (CD) spectroscopy, evidencing a standard CD spectrum of α-helices. Its tertiary/quaternary structure under these conditions was analyzed by Dynamic Light Scattering (DLS), and it was possible to observe different oligomeric arrangements. Based on the polydispersity indices observed in the DLS assays, the means for solubilization of the sample and the temperature were selected for the best probability of crystallization of the set of CB isoforms. This information and the refinement of crystallization conditions of CBa2/CBc, CA2CBb and CBd resulted in single crystals possible convenient for X-ray diffraction experiments aiming the future structural elucidation at the atomic level of the respective isoforms that compose them.

Descrição

Palavras-chave

Cascavel, Crotoxina B, Inibidores, Avaliação enzimática, Caracterização estrutural, Crotalus

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