Efeito da dieta suplementar na fase de cria sobre a metilação do dna do músculo longissimus thoracis de bovinos f1 angus-nelore à desmama

Abstract

Diferentes estratégias têm sido utilizadas para aumentar a deposição de gordura intramuscular na carne produzida no Brasil, a partir, principalmente da raça Nelore (Bos indicus) e de seus cruzamentos, visando melhorar a qualidade do produto e, desta forma, atender demandas de mercados mais exigentes. Uma dessas estratégias é a suplementação na fase de cria por meio do sistema creep-feeding. Entretanto, inexistem ou são escassas as pesquisas que avaliaram o efeito do creep-feeding sobre o estado epigenético e a expressão de genes em bovinos Nelore e em seus cruzamentos com raças taurinas (Bos taurus). Assim, este estudo teve como objetivo analisar os padrões de metilação do DNA genômico (metiloma) na fase de desmama de bovinos cruzados submetidos ou não à suplementação via creep-feeding durante a fase de cria. Foram utilizados 48 bovinos cruzados F1 Angus-Nelore machos, não castrados, meio-irmãos, mantidos a partir dos 30 dias de idade até o desmame sob dois diferentes tratamentos (n = 24/tratamento): grupo 1 (G1) – sem suplementação em creep-feeding; e G2 – com suplementação em creep-feeding. Os animais foram desmamados aos 210 dias, e, em seguida, foram confinados por 180 dias em baias coletivas (três animais/baia) recebendo dieta contendo 12,6% de volumoso e 87,4% de concentrado a base de milho. À desmama foi realizada coleta de amostras do músculo Longissimus thoracis (LT) por meio de biópsia. Após o abate e o resfriamento da carcaça por 24 horas, bifes com 2,54 cm de espessura foram coletados do músculo LT, localizado entre a 12ª e a 13ª vértebras torácicas da meia-carcaça esquerda. Com as amostras do músculo LT do lado esquerdo da carcaça foram determinados: área de olho de lombo (AOL), espessura de gordura subcutânea (EGS), índice de marmorização (IM), teor de gordura intramuscular (IMF) e força de cisalhamento aos sete e 14 dias de maturação (FC7 e FC14). A partir das alíquotas do LT das biópsias da meia carcaça direita foram analisadas as diferenças na expressão gênica global por meio da técnica de sequenciamento do RNA mensageiro (RNA-Seq), entre os tratamentos (G1 vs G2 – 12 indivíduos/grupo) no momento da desmama. A partir do DNA extraído das amostras do LT das biópsias foram analisados os padrões de metilação do genoma (G1 vs G2 – cinco indivíduos/grupo) a fim de investigar se as diferenças de expressão encontradas foram devido à diferenças de metilação do DNA. Para tanto, foi utilizada a técnica de reduced regions bisulfite sequencing (RRBS) em conjunto com pacotes do programa R para análises de bioinformática. Observou-se para os animais do grupo G2 um nível médio de metilação em todo o genoma de 4,25% de CpG, 0,54% de CHG (onde H = A, T ou C) e 0,46% de CHH para os animais do grupo G2. Os valores para os animais do grupo G1 foram de 4,07% de CpG, 0,50% de CHG e 0,43% em CHH, resultando em um nível médio de metilação maior (0,18% de CpG, 0,04% de CHG e 0,03% de CHH) nos animais do grupo suplementado na fase de cria. Foram identificadas ao desmame um total de 974 regiões que apresentaram diferenças nos níveis de metilação (DMRs: >25% e valor q < 0,05). Dessas regiões, 431 evidenciaram hipermetilação no G2, correspondendo a 44,25% do conjunto total, enquanto 543 evidenciaram hipometilação, representando 55,75%. As 974 DMRs prospectadas se sobrepuseram a 241 genes diferencialmente metilados (DMGs). A partir dos 241 DMGs, 39 genes foram relacionados a DEGs com log2 do Fold Change (FC) maior ou igual a 0,5 entre as duas condições experimentais. Análise de enriquecimento funcional mostrou regulações epigenéticas relacionadas a genes envolvidos com crescimento muscular, sinalização PPAR, adipogênese, resposta à insulina, metabolismo lipídico e imunidade. Essas alterações biológicas potencialmente resultaram nos fenótipos observados nos animais suplementados, incluindo melhores desempenho até a desmama e características de qualidade da carne, como a deposição de gordura intramuscular.

Different strategies have been used to increase intramuscular fat deposition in beef produced in Brazil, mainly from Nelore cattle (Bos indicus) and their crosses, aiming to improve product quality and meet the demands of more demanding markets. One of these strategies is supplementation during the suckling phase through creep-feeding systems. However, there is a lack of research or scarce research evaluating the effect of creep-feeding on the epigenetic state and gene expression in Nelore cattle and their crosses with taurine breeds (Bos taurus). Therefore, this study aimed to analyze the patterns of genomic DNA methylation (methylome) during the weaning phase of crossbred cattle subjected or not to creep-feeding supplementation during the suckling phase. Forty-eight F1 AngusNelore crossbred male calves, not castrated, half-siblings, were used from 30 days of age until weaning under two different treatments (n = 24/treatment): group 1 (G1) - without creep-feeding supplementation; and group 2 (G2) - with creepfeeding supplementation. The animals were weaned at 210 days, and then confined for 180 days in collective pens (three animals/pen) receiving a diet containing 12.6% forage and 87.4% corn-based concentrate. Samples of the Longissimus thoracis (LT) muscle were collected at weaning through biopsy. After slaughter and 24-hour carcass chilling, 2,54 cm thick steaks were collected from the LT muscle, located between the 12th and 13th thoracic vertebrae of the left half-carcass. From the left side LT muscle samples, the following parameters were determined: rib eye area (REA), backfat thickness (BT), marbling index (MI), intramuscular fat content (IMF), and shear force at seven and 14 days of aging (SF7 and SF14). Differences in global gene expression were analyzed from right side LT biopsy samples using messenger RNA sequencing (RNA-Seq) between treatments (G1 vs G2 - 12 individuals/group) at the time of weaning. DNA extracted from LT biopsy samples was analyzed for genome methylation patterns (G1 vs G2 - five individuals/group) to investigate whether the differences in expression were due to DNA methylation differences. The reduced regions v bisulfite sequencing (RRBS) technique was used along with R program packages for bioinformatics analysis. The animals in group G2 showed an average genome-wide methylation level of 4.25% CpG, 0.54% CHG (where H = A, T, or C), and 0.46% CHH, while the values for group G1 were 4.07% CpG, 0.50% CHG, and 0.43% CHH, resulting in a higher average methylation level (0.18% CpG, 0.04% CHG, and 0.03% CHH) in the creep-feeding group during the suckling phase. At weaning, a total of 974 regions with differential methylation levels (DMRs: >25% and q value < 0.05) were identified. Of these regions, 431 showed hypermethylation in G2, accounting for 44.25% of the total set, while 543 showed hypomethylation, representing 55.75%. The 974 identified DMRs overlapped with 241 differentially methylated genes (DMGs). Among the 241 DMGs, 39 were related to differentially expressed genes (DEGs) with a log2 Fold Change (FC) greater than or equal to 0.5 between the two experimental conditions. Functional enrichment analysis revealed epigenetic regulations related to genes involved in muscle growth, PPAR signaling, adipogenesis, insulin response, lipid metabolism, and immunity. These biological changes potentially resulted in the observed phenotypes in the supplemented animals, including superior performance up to weaning and meat quality characteristics, such as intramuscular fat.